Vectorette PCR - Vectorette PCR

Эта статья о Vectorette PCR. Для ПЦР см. Полимеразной цепной реакции. Для использования в других целях см. ПЦР (значения).
Этапы ПЦР

Vectorette PCR это вариант полимеразной цепной реакции (ПЦР) разработан в 1988 г.[1] В полимеразной цепной реакции (ПЦР) была создана и запатентована в 1980-х годах.[2] Впервые Vectorette PCR был отмечен и описан в статье в 1990 году Райли и его командой.[3] С тех пор несколько варианты ПЦР были созданы. ПЦР Vectorette фокусируется на амплификации конкретной последовательности, полученной из внутренней последовательности, которая изначально известна до конца фрагмента.[4] Многочисленные исследователи использовали этот метод как возможность для проведения экспериментов, чтобы раскрыть потенциальные возможности использования Vectorette PCR.[1]

Вступление

ПЦР Vectorette похожа на ПЦР с той разницей, что с ее помощью можно получить последовательность, необходимую для амплификации, из уже известного сайта праймера.[5] В то время как для ПЦР требуется информация об уже известных последовательностях на обоих концах, для ПЦР Vectorette требуется только предварительное знание одной из них.[1] Это означает, что можно применить метод ПЦР, который требует информации о последовательности с обоих концов, к фрагментам ДНК которые содержат информацию о последовательности только на одном конце, а не на другом.[6][7] Чтобы достичь этого, этот метод должен сначала пройти определенные шаги. Эти шаги были исследованы с целью выявления научных применений Vectorette PCR и способов их применения.[1]

Шаги

Vectorette PCR может разработать стратегию, обеспечивающую однонаправленную амплификацию ПЦР.[8] Vectorette PCR состоит из трех основных этапов.[1] Первый шаг включает использование рестрикционный фермент для того, чтобы завершить переваривание образца ДНК.[1][6] ДНК, которая будет использоваться для целей исследования, должна быть способна перевариваться рестрикционными ферментами, подходящими для этого гена, в противном случае фрагменты ДНК, которые образуют общую популяцию, не могут быть созданы.[9] После этого библиотека Vectorette объединяется путем лигирования модулей Vectorette в соответствующие Фрагменты ДНК которые были предварительно переварены.[1][6] Лигирование - это процесс связывания двух вещей.[10] Блок Vectorette только частично, а не полностью двухцепочечный, с несовпадающей секцией, расположенной в центре блока.[11] Причина несоответствия заключается в том, чтобы помочь ему избежать попыток праймеров Vectorette вызвать его синтез первой цепи. Таким образом также можно избежать любого неспецифического грунтования.[11] Это лигирование объединяет вектор, который является двухцепочечным, и концы рестрикционных фрагментов, которые были ранее получены на первом этапе.[12] Таким образом, известная последовательность, которая используется для праймирования реакции ПЦР с одной стороны, вводится, в то время как другая праймируется по геномной последовательности, которая уже известна пользователю.[12] Третий и последний шаг состоит из двух частей. Это связано с наличием двух праймеров, инициирующего праймера (IP) и праймера Vectorette (VP), которые действуют на разных стадиях. Во время первой части IP работает над усилением удлинения праймера, в то время как VP остается гибридизированной с продуктом; таким образом, усиление фона на этом этапе не выполняется. Однако это изменяется во время последней и последующей части PCR, поскольку выполняемая инициализация исходит как от IP, так и от VP.[6]

Исследование

Было проведено множество исследований Vectorette PCR и его приложений в области биологии. Ученые использовали Vectorette PCR для определения трансген фланкируя ДНК и изолировать ее. Они использовали этот метод на ДНК, принадлежащей мышам, которая находилась рядом с срезами трансгена. На основе этого ученые смогли показать, что использование Vectorettes способно облегчить восстановление и картирование последовательностей в сложных геномы. Они также обнаружили, что Vectorette PCR может помочь в анализе последовательностей путем субвекторетирования, когда речь идет о продуктах PCR большого размера.[5]

Другая работа посвящена разработке метода с использованием Vectorette PCR для выполнения геномной ходьбы. Используя Vectorette PCR, ученые смогли получить одноцепочечную ДНК, полученную из продуктов PCR, для их секвенирования. Исходя из этого, был идентифицирован подход, в котором возможна амплификация последовательностей, которые ранее не были охарактеризованы. Это исследование демонстрирует, как можно быстро разработать новые последовательности, если для начала используется только известная последовательность ДНК.[6]

Дальнейшие исследования заключались в создании метода, который продвигает изоляцию микросателлитных повторов. Используя Vectorette PCR, исследователи нашли быстрый способ достичь этого с помощью новых микросателлитных повторов. Они попытались и преуспели в использовании этой техники для выделения шести микросателлитных повторов.[13]

ПЦР Vectorette также использовалась не только для определения геномных позиций вставочных последовательностей (IS), но и для их картирования. Исследования в этой области пролили свет на способ завершения типирования микробных пятен, а также идентификации и картирования таких вещей, как сайты инсерции IS, которые находятся в микробных геномах. Vectorette PCR оказывается полезным, когда дело доходит до быстрого и простого исследования элементов IS генома.[14]

Переносной элемент, транспозон или TE представляет собой разновидность генетических элементов, способных изменять свое положение в геноме с помощью процесса, называемого «прыжком».[15] Дисплей TE предназначен для представления различных вариантов сайтов вставки TE, что помогает создавать многочисленные доминирующие маркеры.[16] Проблема, которая возникла в первоначальном методе, заключалась в том, чтобы найти метод ПЦР, который был способен быть специфичным и эффективным в отношении вывода транспозона в геном.[16] Исследователи нашли решение этой проблемы, используя Vectorette PCR в качестве метода ПЦР. Поскольку Vectorette PCR может быть специфичным с помощью выделения и амплификации генов, это помогло в их исследованиях и помогло улучшить метод отображения TE за счет экономии времени и затрат.[16] Затем исследователи смогли получить множество доминантных маркеров с помощью Vectorette PCR, основанного на нерадиоактивном TE-дисплее.[16]

Лимфома щитовидной железы болезнь, которая приводит к трансформации лимфоциты принадлежащих щитовидной железе к клеткам злокачественной природы.[17] Исследователи протестировали новый метод, который помогает в диагностике этого состояния. Использование Vectorette PCR было объединено с перевариванием рестриктазами, и было обнаружено, что Vectorette PCR оказался полезным в их исследовании и помог в диагностике лимфомы щитовидной железы.[18]

Исследователи изучили возможность использования Vectorette PCR для изучения генов болезней. Они использовали два метода, тринуклеотидные повторы которые специально используются для нацеливания на транскрибируемые области и ПЦР Vectorette, чтобы получить простая последовательность повторений или SSR.[19] Считается, что из этих SSR можно получить генетические маркеры. Ожидается, что результаты этого исследования помогут исследователям попытаться получить генетические маркеры, которые можно переносить из неизвестных геномов. Vectorette PCR использовали для выявления SSR, фланкирующих тринуклеотидный повтор, который был нацелен для тестирования.[19] Это также известно как TNR или тринуклеотидная ПЦР Vectorette. Они считают, что их метод TNR в сочетании с амплификацией, обеспечиваемой Vectorette PCR, можно использовать в эукариоты создавать молекулярные маркеры основанные на простых повторяющихся последовательностях. Исследователи также считают, что этот метод будет полезен при попытке выделить гены, которые могут вызывать заболевания.[19]

Использует

Использование Vectorette PCR во многих случаях было полезно для науки биология. Например, это приводит к появлению методов, которые могут помочь во время вспышек заболеваний, упрощая подтип патогены которые похожи или тесно связаны.[14] Его также можно использовать для диагностики определенных заболеваний.[18] Ранее на этой странице отмечалось, что Vectorette PCR может вызвать множество функций, которые могут быть выполнены с новыми последовательностями ДНК, расположенными рядом с уже известной последовательностью. Эти функции, такие как выделение ДНК, ее амплификация и анализ, лежат в основе использования Vectorette PCR.[1] Эти применения включают такие вещи, как ходьба по геному, секвенирование ДНК для концов дрожжевых искусственных хромосом (YAC) и космидных вставок, возможность картировать интроны и промоторы в геномной ДНК и областях с мутациями, облегчая секвенирование клонов большого размера, и заполнение пробелов, возникающих при картировании геномов.[1]

An интрон представляет собой последовательность ДНК, фланкированную экзоны и поэтому находится между ними.[20] Это область, которая вырезается при экспрессии экзонов, поэтому интроны не влияют на код аминокислот. На экспрессию генов может влиять только ряд интронных последовательностей.[20] Было обнаружено, что ПЦР Vectorette полезна, когда дело доходит до характеристики этих интронных последовательностей, когда обнаруживается, что они находятся рядом с известными последовательностями.[21]

кДНК или комплементарная ДНК представляет собой последовательность ДНК, которая комплементарна РНК, которая является матрицей при синтезе ДНК в процессе обратной транскриптазы.[22] ПЦР Vectorette, в которой используются праймеры, происходящие из кДНК, дает начало способу получения последовательностей интронов, которые расположены рядом с экзонами и помогают в развитии структуры генов.[23] Этого можно добиться при инициализации процесса с помощью последовательности кДНК и клона генома.[23]

Vectorette PCR также дает пользователю преимущество по сравнению с использованием других существующих технологий. Пользователь сможет выполнять такие задачи, как бесклеточные манипуляции с генами, Vectorette PCR с минимальным количеством материала для начала и выполнение Vectorette PCR с ДНК, которая не обязательно должна быть высокой чистоты. Эти преимущества позволяют пользователю экономить время и ресурсы, увеличивая при этом диапазон ДНК, на которую можно воздействовать.[1]

Хромосомная ходьба

Хромосомная ходьба может использоваться с целью клонирование ген.[24] Это достигается за счет использования наиболее близких маркеров известных генов, и поэтому их можно использовать в таких методах, как выделение последовательностей ДНК и помощь в секвенировании и клонировании ДНК организмов. Хромосомная прогулка также полезна, когда дело доходит до заполнения пробелов, которые могут присутствовать в геномах, путем обнаружения клонов, которые перекрываются с концом клона библиотеки. Это означает, что для выполнения прогулки по хромосомам требуется библиотека клонов геномного формата. Вот почему Vectorette PCR - один из методов, который можно использовать для создания этой библиотеки для прохождения хромосом. Vectorette PCR пригодится, когда необходимо получить области, которые расположены как вверх, так и вниз по течению, и фланкируют уже известную последовательность. Получая эти области, он предоставляет библиотеку геномного формата, необходимого для ходьбы по хромосомам.[нужна цитата ]

Искусственная хромосома дрожжей

Искусственная хромосома дрожжей или YAC - это молекула ДНК, которая разработана людьми для взятия последовательностей ДНК, принадлежащих дрожжевым клеткам, и их клонирования.[25] В искусственные хромосомы дрожжей можно вставить фрагменты ДНК из интересующего организма. Затем дрожжевые клетки ассимилируют искусственную хромосому дрожжей, которая содержит ДНК интересующего организма.[25] В дрожжи Затем клетки размножаются в количестве, и это приводит к амплификации ДНК, которая была включена в нее, которая затем выделяется для таких целей, как секвенирование и картирование желаемой ДНК, то есть ДНК, изначально вставленной в искусственную хромосому дрожжей.[25] Vectorette PCR помогает в этом процессе, обеспечивая не только изоляцию концов искусственных хромосом дрожжей, но и амплификацию концов.[26]

Рекомендации

  1. ^ а б c d е ж грамм час я j "Руководство по эксплуатации системы Vectorette Gene Walking Made Easy" (PDF). 2019.
  2. ^ «Полимеразная цепная реакция (ПЦР)». www.ncbi.nlm.nih.gov. Получено 2019-05-11.
  3. ^ Райли Дж, Батлер Р., Огилви Д., Финниер Р., Дженнер Д., Пауэлл С., Ананд Р., Смит Дж. К., Маркхэм А.Ф. (май 1990 г.). «Новый быстрый метод выделения концевых последовательностей из клонов искусственной хромосомы дрожжей (YAC)». Исследования нуклеиновых кислот. 18 (10): 2887–90. Дои:10.1093 / nar / 18.10.2887. ЧВК  330815. PMID  2161516.
  4. ^ "vectorette PCR - Терминология молекулярной биологии для векторной ПЦР - GenScript". www.genscript.com. Получено 2019-05-11.
  5. ^ а б Аллен М.Дж., Коллик А., Джеффрис А.Дж. (октябрь 1994 г.). «Использование векторной и субвекторетной ПЦР для выделения ДНК, фланкирующей трансген». Методы и применение ПЦР. 4 (2): 71–5. Дои:10.1101 / гр.4.2.71. PMID  7580887.
  6. ^ а б c d е Арнольд С., Ходжсон И. Дж. (Август 1991 г.). «Vectorette PCR: новый подход к геномной ходьбе». Методы и применение ПЦР. 1 (1): 39–42. Дои:10.1101 / гр.1.1.39. PMID  1842919.
  7. ^ «Введение в систему Vectorette» (PDF). Получено 11 мая 2019.
  8. ^ Макферсон, М. Дж. (2000). ПЦР. Мёллер, С. Г. Оксфорд: BIOS. п. 235. ISBN  978-0585425306. OCLC  50760423.
  9. ^ Протоколы клонирования ПЦР. Чен, Бинг-Юань., Джейнс, Гарри В. (2-е изд.). Тотова, Нью-Джерси: Humana Press. 2002. С.278. ISBN  0585403341. OCLC  50175114.CS1 maint: другие (связь)
  10. ^ «Определение ЛИГАЦИИ». www.merriam-webster.com. Получено 2019-05-12.
  11. ^ а б Протоколы клонирования ПЦР. Чен, Бинг-Юань., Джейнс, Гарри В. (2-е изд.). Тотова, Нью-Джерси: Humana Press. 2002. С.276. ISBN  0585403341. OCLC  50175114.CS1 maint: другие (связь)
  12. ^ а б Каммак Р., Этвуд Т., Кэмпбелл П., Пэриш Н., Смит А., Велла Ф., Стирлинг Дж., Ред. (01.01.2006). Оксфордский словарь биохимии и молекулярной биологии (2-е изд.). Издательство Оксфордского университета. Дои:10.1093 / acref / 9780198529170.001.0001. ISBN  9780198529170.
  13. ^ Ленч Нью-Джерси, Норрис А., Бейли А., Стенд А, Маркхэм А.Ф. (июнь 1996 г.). «Выделение последовательностей микросателлитных повторов с помощью ПЦР Vectorette с использованием заякоренных праймеров динуклеотидных повторов». Исследования нуклеиновых кислот. 24 (11): 2190–1. Дои:10.1093 / nar / 24.11.2190. ЧВК  145905. PMID  8668553.
  14. ^ а б Чжун С., Дин AM (июль 2004 г.). «Быстрая идентификация и картирование инсерционных последовательностей в геномах Escherichia coli с использованием векторной ПЦР». BMC Microbiology. 4: 26. Дои:10.1186/1471-2180-4-26. ЧВК  481064. PMID  15242519.
  15. ^ "Транспозон | генетика". Энциклопедия Британника. Получено 2019-05-31.
  16. ^ а б c d Ван, Цзяньцзюнь; Миллер, Томас А .; Пак, Юнсон (2006). «Разработка множественных доминантных маркеров с использованием нерадиоактивного мобильного дисплея на основе ПЦР Vectorette». Заметки о молекулярной экологии. 6 (3): 642–645. Дои:10.1111 / j.1471-8286.2006.01403.x. ISSN  1471-8286.
  17. ^ "Лимфома щитовидной железы | Хирургический факультет Колумбийского университета". columbiasurgery.org. Получено 2019-05-17.
  18. ^ а б Такано Т., Асахи С., Мацузука Ф., Хидака И., Ёсида Х., Мияути А. (январь 2008 г.). «Аспирационная биопсия-нуклеиновая кислота диагностика злокачественной лимфомы щитовидной железы с помощью векторной ПЦР: опыт восьми случаев». Исследование лейкемии. 32 (1): 151–4. Дои:10.1016 / j.leukres.2007.03.019. PMID  17442390.
  19. ^ а б c Иларио, Елена; Фрейзер, Лена Г .; МакНейлаж, Марк (2009-03-10). «Тринуклеотидные повторы в качестве приманки для Vectorette PCR: инструмент для разработки маркеров генетического картирования». Молекулярная биотехнология. 42 (3): 320–326. Дои:10.1007 / s12033-009-9157-9. ISSN  1073-6085. PMID  19277911.
  20. ^ а б «Определение интрона - Словарь терминов NCI по раку». Национальный институт рака. 2012-07-20. Получено 2019-05-31.
  21. ^ Rubie, C .; Schulze-Bahr, E .; Wedekind, H .; Borggrefe, M .; Haverkamp, ​​W .; Брайтхардт, Г. (сентябрь 1999 г.). "Многоступенчатая сенсорная векторизация-ПЦР - быстрый метод определения IVS в генах". Биотехнологии. 27 (3): 414–418. Дои:10.2144 / 99273bm03. ISSN  0736-6205. PMID  10489595.
  22. ^ «Определение CDNA». www.merriam-webster.com. Получено 2019-05-31.
  23. ^ а б Робертс, Роланд Дж .; Коффи, Элисон Дж .; Бобров, Мартин; Бентли, Дэвид Р. (август 1992 г.). «Определение структуры экзона дистальной части гена дистрофина с помощью векторной ПЦР». Геномика. 13 (4): 942–950. Дои:10.1016 / 0888-7543 (92) 90005-Д. PMID  1505985.
  24. ^ «Хромосомная ходьба». Defined Term - Словарь определенных терминов для юридической профессии. Получено 2019-05-31.
  25. ^ а б c «Искусственная хромосома дрожжей (YAC)». Genome.gov. Получено 2019-05-31.
  26. ^ Kleyn PW, Wang CH, Lien LL, Vitale E, Pan J, Ross BM, Grunn A, Palmer DA, Warburton D, Brzustowicz LM (июль 1993 г.). «Создание дрожжевого искусственного хромосомного контига, охватывающего область гена мышечной атрофии позвоночника». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки. 90 (14): 6801–5. Bibcode:1993ПНАС ... 90.6801K. Дои:10.1073 / pnas.90.14.6801. ЧВК  47020. PMID  8341701.