Комплементарная ДНК - Complementary DNA

"CDNA" перенаправляется сюда. Для использования в других целях см. CDNA (значения).
Об общем свойстве комплементарности в молекулярной биологии см. Комплементарность (молекулярная биология). Для получения информации о тестах комплементации, используемых в генетических исследованиях, см. Комплементация (генетика).

Выход из кДНК микрочип используется в тестировании

В генетика, комплементарная ДНК (кДНК) является ДНК синтезируется из одноцепочечной РНК (например, матричная РНК (мРНК ) или же микроРНК (miRNA)) матрица в реакции, катализируемой ферментом обратная транскриптаза. кДНК часто используется для клонирования эукариотический гены в прокариоты. Когда ученые хотят выражать особый белок в клетке, которая обычно не экспрессирует этот белок (т.е. гетерологичный экспрессия), они передадут кДНК, которая кодирует белок, в клетку-реципиент. В молекулярной биологии кДНК также генерируется для анализа транскриптомный профили в объеме ткани, отдельных клетках или отдельных ядрах в таких анализах, как микрочипы и РНК-последовательность.

кДНК также производится естественным путем ретровирусы (Такие как ВИЧ-1, ВИЧ-2, вирус обезьяньего иммунодефицита и т. д.), а затем интегрируется в геном хозяина, где создает провирус.[1]

Период, термин кДНК также используется, как правило, в биоинформатика в контексте, для обозначения последовательности транскрипта мРНК, выраженной в виде оснований ДНК (GCAT), а не оснований РНК (GCAU).

Синтез

РНК служит шаблоном для синтеза кДНК.[2] В клеточной жизни кДНК генерируется вирусами и ретротранспозонами для интеграции РНК в мишень. геномная ДНК. В молекулярной биологии РНК очищается из исходного материала после удаления геномной ДНК, белков и других клеточных компонентов. кДНК затем синтезируется через in vitro обратная транскрипция.[3]

Очистка РНК

РНК транскрибируется с геномной ДНК в клетках-хозяевах и извлеченный сначала лизать клетки затем очищают РНК с использованием широко используемых методов, таких как фенол-хлороформ, колонка с диоксидом кремния и методы экстракции РНК на основе гранул.[4] Методы экстракции различаются в зависимости от исходного материала. Например, для извлечения РНК из растительной ткани требуются дополнительные реагенты, такие как поливинилпирролидон (ПВП), для удаления фенольных соединений, углеводов и других соединений, которые в противном случае сделают РНК непригодной для использования.[5] Чтобы удалить ДНК и белки, используются ферменты, такие как ДНКаза и протеиназа К.[6] Важно отметить, что целостность РНК поддерживается путем инактивации РНКаз с помощью хаотропных агентов, таких как изотиоцианат гуанидиния, додецилсульфат натрия (SDS), фенол или хлороформ. Затем общая РНК отделяется от других клеточных компонентов и осаждается спиртом. Существуют различные коммерческие наборы для простого и быстрого выделения РНК для конкретных приложений.[7] Дополнительные методы на основе гранул могут использоваться для выделения определенных подтипов РНК (например, мРНК и микроРНК ) в зависимости от размера или уникальных участков РНК.[8][9]

Обратная транскрипция

Синтез первой цепи

Используя фермент обратной транскриптазы и очищенные матрицы РНК, получают одну цепь кДНК (синтез первой цепи кДНК). Обратная транскриптаза M-MLV из вируса лейкемии мышей Молони широко используется из-за ее пониженного РНКаза H активность, подходящая для транскрипции более длинных РНК.[10] Обратная транскриптаза AMV из вируса миелобластоза птиц также может использоваться для матриц РНК с сильными вторичными структурами (то есть с высокой температурой плавления).[11] кДНК обычно генерируется из мРНК для анализов экспрессии генов, таких как ОТ-КПЦР и РНК-последовательность.[12] мРНК избирательно обратно транскрибируется с использованием олиго-dТ праймеры, которые являются обратным дополнением полиаденилированный хвост на 3'-конце всей мРНК. Оптимизированная смесь олиго-dT и случайный гексамер праймеры увеличивают шанс получения полноразмерной кДНК при одновременном снижении смещения 5 'или 3'.[13] Рибосомная РНК могут также быть истощены для обогащения как мРНК, так и неполиаденилированных транскриптов, таких как некоторые некодирующая РНК.[14]

Синтез второй цепи

Результат синтезов первой цепи, гибриды РНК-ДНК, можно обрабатывать с помощью нескольких методов синтеза второй цепи или обрабатывать непосредственно в последующих анализах.[15][16] Ранний метод, известный как синтез с шпилькой, основывался на образовании шпильки на 3'-конце кДНК первой цепи для запуска синтеза второй цепи. Однако затравка носит случайный характер, и шпильочный гидролиз приводит к потере информации. В процедуре Габлера и Хоффмана используется РНКаза H E. Coli для разрыва мРНК, которая заменяется на E. Coli ДНК-полимераза Я и запечатанный кишечной палочкой ДНК-лигаза. Оптимизация этой процедуры основана на низкой активности РНКазы H в M-MLV для разрыва мРНК с последующим удалением оставшейся РНК путем добавления РНКазы H после трансляции ДНК-полимеразы кДНК второй цепи. Это предотвращает потерю информации о последовательности на 5'-конце мРНК.

Приложения

Комплементарная ДНК часто используется в клонирование генов или как генные зонды или в создании библиотека кДНК. Когда ученые переносят ген из одной клетки в другую, чтобы выразить новый генетический материал в виде белка в клетке-реципиенте, кДНК будет добавлена ​​к реципиенту (а не ко всему гену), потому что ДНК для всего гена может включать ДНК, которая не кодирует белок или прерывает кодирующую последовательность белка (например, интроны ). Частичные последовательности кДНК часто получают как выраженные теги последовательности.

С амплификацией последовательностей ДНК через полимеразной цепной реакции (ПЦР) сейчас обычное дело, обычно на начальном этапе проводят обратную транскрипцию, за которой следует ПЦР для получения точной последовательности кДНК для внутриклеточной экспрессии. Это достигается путем конструирования специфичных для последовательности праймеров ДНК, которые гибридизуются с 5'- и 3'-концами области кДНК, кодирующей белок. После амплификации последовательность может быть разрезана с каждого конца нуклеазами и вставлена ​​в одну из множества небольших кольцевых последовательностей ДНК, известных как векторы экспрессии. Такие векторы обеспечивают саморепликацию внутри клеток и, возможно, интеграцию в ДНК хозяина. Обычно они также содержат сильный промотор для управления транскрипцией целевой кДНК в мРНК, которая затем транслируется в белок.

13 июня 2013 г. Верховный суд США вынесено решение в случае Ассоциация молекулярной патологии против Myriad Genetics что естественные человеческие гены не могут быть запатентованный, кДНК имеет право на получение патента, поскольку не встречается в природе.[17]

кДНК также используется для изучения экспрессии генов с помощью таких методов, как RNA-seq или ОТ-КПЦР.[18][19][20] Для секвенирования РНК должна быть фрагментирована из-за ограничений размера платформы секвенирования. Кроме того, кДНК, синтезированная второй цепью, должна быть лигирована с адаптерами, которые позволяют фрагментам кДНК амплифицироваться с помощью ПЦР и связываться с секвенирующими проточными клетками. В методах анализа генов обычно используются микроматрицы и RT-qPCR для количественной оценки уровней кДНК с помощью флуорометрических и других методов.

Вирусы и ретротранспозоны

Некоторые вирусы также используют кДНК для превращения своей вирусной РНК в мРНК (вирусная РНК → кДНК → мРНК). МРНК используется для того, чтобы вирусные белки захватили хозяйскую клетку.

Пример этого первого шага от вирусной ДНК к кДНК можно увидеть в цикле ВИЧ-инфекции. Здесь мембрана клетки-хозяина прикрепляется к липидной оболочке вируса, что позволяет вирусному капсиду с двумя копиями РНК вирусного генома проникать в хозяина. Затем создается копия кДНК посредством обратной транскрипции вирусной РНК, процессу, который облегчается шапероном CypA и обратной транскриптазой, связанной с вирусным капсидом.[21]

кДНК также генерируется ретротранспозоны в геномах эукариот. Ретротранспозоны - это мобильные генетические элементы, которые перемещаются внутри генома, а иногда и между геномами через промежуточные соединения РНК. Этот механизм характерен для вирусов за исключением образования инфекционных частиц.[22][23]

Смотрите также

Рекомендации

  1. ^ Крой, Рон. «Молекулярная генетика II - Курс генной инженерии (Дополнительные примечания)». Даремский университет durham.ac.uk; 20 апреля 1998 г.. Архивировано из оригинал 24 августа 2002 г.. Получено 4 февраля 2015.
  2. ^ Инь, Шао-Яо (1 июля 2004 г.). «Дополнительные библиотеки ДНК». Молекулярная биотехнология. 27 (3): 245–252. Дои:10.1385 / МБ: 27: 3: 245. ISSN  1559-0305. PMID  15247497. S2CID  25600775.
  3. ^ «5 шагов к оптимальному синтезу кДНК - США». www.thermofisher.com. Получено 12 мая 2020.
  4. ^ Таварес, Луселия; Alves, Paula M .; Ferreira, Ricardo B .; Сантос, Клаудия Н. (6 января 2011 г.). «Сравнение различных методов выделения РНК без ДНК из нейробластомы SK-N-MC». BMC Research Notes. 4 (1): 3. Дои:10.1186/1756-0500-4-3. ISSN  1756-0500. ЧВК  3050700. PMID  21211020.
  5. ^ R, Кансал; К. Кухар; Я, Верма; Р-н, Гупта; ВК, Гупта; Кр, Кундал (декабрь 2008 г.). «Улучшенный и удобный метод выделения РНК из полифенолов и богатых полисахаридами растительных тканей». Индийский журнал экспериментальной биологии. 46 (12): 842–5. PMID  19245182.
  6. ^ Я, Вомелова; Z, Vanícková; А, Седо (2009). "Методы очистки РНК. Все пути (должны) вести в Рим". Folia Biologica. 55 (6): 243–51. PMID  20163774.
  7. ^ Селлин Джеффрис, Марло К .; Поцелуй, Андор Дж .; Смит, Остин В .; Орис, Джеймс Т. (14 ноября 2014 г.). «Сравнение имеющихся в продаже наборов для автоматизированной и ручной экстракции для выделения общей РНК из небольших образцов тканей». BMC Biotechnology. 14 (1): 94. Дои:10.1186 / s12896-014-0094-8. ISSN  1472-6750. ЧВК  4239376. PMID  25394494.
  8. ^ «Выделение мРНК с помощью Dynabeads за 15 минут - США». www.thermofisher.com. Получено 20 мая 2020.
  9. ^ Гаарц, Андреа; Дебей-Пашер, Свенья; Классен, Сабина; Эггл, Даниэла; Гатхоф, Биргит; Чен, Цзин; Фань, Цзянь-Бин; Восс, Торстен; Schultze, Joachim L .; Старачек-Йокс, Андреа (май 2010 г.). «Профилирование экспрессии микроРНК в периферической крови на основе бусин и влияние различных подходов к изоляции РНК». Журнал молекулярной диагностики: JMD. 12 (3): 335–344. Дои:10.2353 / jmoldx.2010.090116. ISSN  1525-1578. ЧВК  2860470. PMID  20228267.
  10. ^ Хаддад, Фадиа; Болдуин, Кеннет М. (2010), Кинг, Никола (редактор), «Обратная транскрипция рибонуклеиновой кислоты: первый шаг в анализе ОТ-ПЦР», Протоколы ОТ-ПЦР: второе издание, Методы молекулярной биологии, Humana Press, 630, стр. 261–270, Дои:10.1007/978-1-60761-629-0_17, ISBN  978-1-60761-629-0, PMID  20301003
  11. ^ Мартин, Карен. "Обратная транскриптаза и обзор кДНК и приложения". Золотая биотехнология. Получено 20 мая 2020.
  12. ^ «КПЦР, микроматрицы или секвенирование РНК - что выбрать?». БиоСистемика. 10 августа 2017 г.. Получено 20 мая 2020.
  13. ^ "Синтез кДНК | Био-Рад". www.bio-rad.com. Получено 28 мая 2020.
  14. ^ Герберт, Захари Т .; Кершнер, Джейми П .; Бутти, Винсент Л .; Тиммапурам, Джьоти; Чоудхари, Сульбха; Алексеев, Юрий О .; Fan, Jun; Поднар, Джессика В .; Уилкокс, Эдвард; Гипсон, Дженни; Гилласпи, Эллисон (15 марта 2018 г.). «Межсайтовое сравнение наборов для истощения рибосом для создания библиотеки Illumina RNAseq». BMC Genomics. 19 (1): 199. Дои:10.1186 / s12864-018-4585-1. ISSN  1471-2164. ЧВК  6389247. PMID  29703133.
  15. ^ Invitrogen. «Система синтеза кДНК» (PDF). Термофишер. Получено 27 мая 2020.
  16. ^ Агарвал, Саураб; Macfarlan, Todd S .; Sartor, Maureen A .; Ивасе, Шигеки (21 января 2015 г.). «Секвенирование библиотеки кДНК первой цепи выявляет транскриптомы полной длины». Nature Communications. 6 (1): 6002. Bibcode:2015 НатКо ... 6.6002A. Дои:10.1038 / ncomms7002. ISSN  2041-1723. ЧВК  5054741. PMID  25607527.
  17. ^ Липтак, Адам (13 июня 2013 г.). «Верховный суд постановил, что гены человека не могут быть запатентованы». Нью-Йорк Таймс. Получено 14 июн 2013.
  18. ^ Derisi, J .; Penland, L .; Brown, P.O .; Bittner, M. L .; Meltzer, P. S .; Ray, M .; Chen, Y .; Вс, Ю. А .; Трент, Дж. М. (декабрь 1996 г.). «Использование микроматрицы кДНК для анализа паттернов экспрессии генов при раке человека». Природа Генетика. 14 (4): 457–460. Дои:10.1038 / ng1296-457. ISSN  1546-1718. PMID  8944026. S2CID  23091561.
  19. ^ Белый, Адам К .; ВанИнсберге, Майкл; Петров, Олег И .; Хамиди, Мани; Сикорский, Дарек; Марра, Марко А .; Пирет, Джеймс; Апарисио, Самуэль; Хансен, Карл Л. (23 августа 2011 г.). «Высокопроизводительная микрофлюидная одноклеточная RT-qPCR». Труды Национальной академии наук. 108 (34): 13999–14004. Bibcode:2011PNAS..10813999W. Дои:10.1073 / pnas.1019446108. ISSN  0027-8424. ЧВК  3161570. PMID  21808033.
  20. ^ Хрдликова, Радмила; Толуэ, Масуд; Тиан, Бин (январь 2017 г.). «Методы RNA-Seq для анализа транскриптомов». Междисциплинарные обзоры Wiley. РНК. 8 (1): e1364. Дои:10.1002 / wrna.1364. ISSN  1757-7004. ЧВК  5717752. PMID  27198714.
  21. ^ Альтфельд, Маркус; Младший, Майкл Гейл (1 июня 2015 г.). «Врожденный иммунитет против ВИЧ-1 инфекции». Иммунология природы. 16 (6): 554–562. Дои:10.1038 / ni.3157. ISSN  1529-2908. PMID  25988887. S2CID  1577651.
  22. ^ Хавекер, Эрика Р .; Гао, Сян; Войтас, Даниэль Ф. (18 мая 2004 г.). «Разнообразие ретротранспозонов LTR». Геномная биология. 5 (6): 225. Дои:10.1186 / gb-2004-5-6-225. ISSN  1474-760X. ЧВК  463057. PMID  15186483.
  23. ^ Кордо, Ричард; Батцер, Марк А. (октябрь 2009 г.). «Влияние ретротранспозонов на эволюцию генома человека». Природа Обзоры Генетика. 10 (10): 691–703. Дои:10.1038 / nrg2640. ISSN  1471-0064. ЧВК  2884099. PMID  19763152.

внешняя ссылка