Cyanidioschyzon merolae - Википедия - Cyanidioschyzon merolae

Cyanidioschyzon merolae
Cyanidioschyzon merolae 10D.jpg
Научная классификация редактировать
(без рейтинга):Archaeplastida
Разделение:Родофита
Учебный класс:Cyanidiophyceae
Заказ:Цианидиалы
Семья:Цианидиевые
Род:Cyanidioschyzon
Разновидность:
С. merolae
Биномиальное имя
Cyanidioschyzon merolae
П. Де Лука, Р. Таддеи и Л. Варано, 1978[1]

Cyanidioschyzon merolae представляет собой небольшой (2 мкм) булавовидный одноклеточный гаплоидный красная водоросль адаптирован к высокосернистой среде горячих источников (pH 1,5, 45 ° C).[2][3] Сотовая архитектура C. merolae чрезвычайно прост, содержит только один хлоропласт и один митохондрия и отсутствие вакуоль и клеточная стенка.[4] Кроме того, сотовая связь и органелла подразделения могут быть синхронизированы. Поэтому, С. merolae считается отличной модельной системой для изучения процессов деления клеток и органелл, а также биохимия и структурная биология.[5][6][7] Организм геном был первым полным геномом водорослей, последовательный в 2004 г .;[8] его пластида была секвенирована в 2000 и 2003 годах, а его митохондрия - в 1998 году.[9] Организм считается простейшим из эукариотических клеток из-за его минималистичной клеточной организации.[10]

Выращивание красной водоросли С. merolae в колбах и 10-литровом бутыль. Хотя классифицируется как красная водоросль, С. merolae сине-зеленый: красный пигмент практически отсутствует. фикоэритрин,[11] и, следовательно, отображает только второй пигмент красных водорослей, фикоцианин, и зеленый пигмент хлорофилл.[11]

Изоляция и рост в культуре

Первоначально выделен Де Лука в 1978 году из сольфатана. фумаролы Кампи Флегрей (Неаполь, Италия ),[2] С. merolae можно выращивать в культура в лаборатории в модифицированной среде Аллена (МА)[7] или модифицированная форма с удвоенной концентрацией некоторых элементов, называемая MA2.[10][12] При использовании среды MA скорость роста не очень быстрая, с время удвоения (время, необходимое культуре микробов, чтобы удвоить количество клеток на единицу объема) примерно 32 часа.[7] Используя более оптимальную среду MA2, это можно сократить до 24 часов.[7] Культивирование проводят при 42 ° C под белым флуоресцентным светом с приблизительной интенсивностью 50 мкмоль фотонов м.−2 s−1 (µE).[10] Однако при более высокой интенсивности света 90 мкЕ с 5% CO2 при барботировании скорость роста С. merolae может быть увеличена вдвое примерно на 9,2 часа.[7] Более высокий свет не обязательно полезен, так как выше 90 µE скорость роста начинает уменьшаться.[7] Это может быть связано с фотоповреждением фотосинтетического аппарата. С. merolae также могут выращиваться на чашках с геллановой камедью для селекции колоний или поддержания штаммов в лаборатории.[7] С. merolae облигатный оксигенный фототроф, что означает, что он не способен поглощать фиксированный углерод из окружающей среды и должен полагаться на кислородный фотосинтез, чтобы связывать углерод из CO.2.[10]

Геном

16,5 пара мегабаз геном C. merolae была секвенирована в 2004 году.[3] Уменьшенный, чрезвычайно простой, компактный геном состоит из 20 хромосом и, как было установлено, содержит 5 331 ген, из которых 86,3% экспрессируются и только 26 содержат интроны, который содержал строгие консенсусные последовательности.[3] Поразительно, но геном С. merolae содержит всего 30 генов тРНК и крайне минимальное количество копий гена рибосомной РНК,[3] как показано в таблица сравнения генома. Уменьшенная природа генома привела к нескольким другим необычным особенностям. Хотя большинство эукариот содержат около 10 копий динамины требуется для прижимания мембран к разделению перегородок, С. merolae всего два,[3] факт, которым исследователи воспользовались при изучении деления органелл.

Несмотря на небольшой геном,[8] геном хлоропласта С. merolae содержит много генов, отсутствующих в геномах хлоропластов других водорослей и растений.[13] Большинство его генов не имеют интронов.[8]

Молекулярная биология

Как и в случае с большинством модельных организмов, генетические инструменты были разработаны в C. merolae. К ним относятся методы выделения ДНК и РНК из С. merolae, введение ДНК в С. merolae для временной или стабильной трансформации, а также способы отбора, включая ауксотроф урацила, который можно использовать в качестве маркера отбора.

Выделение ДНК

Несколько методов, производных от цианобактериальный протоколы, используются для выделения ДНК из С. merolae.[10][14] Первый - это экстракция горячим фенолом, которая представляет собой быструю экстракцию, которую можно использовать для выделения ДНК, подходящей для амплификации ДНК. полимеразной цепной реакции (ПЦР),[10][15] где фенол добавляют к целым клеткам и инкубируют при 65 ° C для экстракции ДНК.[10] Если требуется более чистая ДНК, можно использовать метод CTAB (бромид цетилтриметиламмония). В этом методе сначала применяется буфер для экстракции с высоким содержанием соли, и клетки разрушаются, после чего смесь хлороформ-фенол используется для экстракции ДНК при комнатной температуре.[10]

Выделение РНК

Общая РНК может быть извлечена из С. merolae клетки, используя вариант метода горячего фенола, описанный выше для ДНК.[10]

Экстракция белка

Как и в случае с ДНК и РНК, протокол экстракции белка также является адаптацией протокола, используемого для цианобактерий.[10][16] Клетки разрушают с помощью стеклянных шариков и встряхивания в 10% глицериновом буфере, содержащем восстанавливающий агент DTT, для разрыва дисульфидных связей в белках.[10] Эта экстракция приведет к денатурированным белкам, которые можно использовать в SDS-СТРАНИЦА гели для Вестерн-блоттинг и Кумасси окрашивание.

Выбор трансформанта и ауксотрофная линия урацила

С. merolae чувствителен ко многим антибиотики обычно используется для отбора успешно трансформированных особей в лаборатории, но устойчив к некоторым, особенно ампициллин и канамицин.[7][17]

Обычно используемый маркер выбора для превращения в С. merolae включает урацил ауксотроф (требуется экзогенный урацил). Мутант был разработан путем выращивания C. merolae в присутствии соединения 5-FOA, которое само по себе нетоксично, но превращается в токсичное соединение 5-фторурацил под действием фермента пути биосинтеза урацила, оротидин-5'-монофосфат (OMP) декарбоксилазы, кодируемого посредством Ura5.3 ген.[7] Случайная мутация привела к появлению нескольких мутантов с потерей функции в Ura5.3, что позволяло клеткам выживать в присутствии 5-FOA до тех пор, пока был предоставлен урацил.[7] Путем трансформации этого мутанта фрагментом ПЦР, несущим как интересующий ген, так и функциональную копию Ura5.3, исследователи могут подтвердить, что интересующий ген был включен в C. merolae геном, если он может расти без экзогенного урацила.

Временная экспрессия, опосредованная полиэтиленгликолем (ПЭГ)

В то время как хромосомная интеграция генов создает стабильный трансформант, временная экспрессия позволяет проводить краткосрочные эксперименты с использованием меченых или модифицированных генов в C. merolae. Переходное выражение может быть достигнуто с помощью полиэтиленгликоль (PEG) метод в протопласты (клетки растений с жесткой клеточной стенкой, удаленной ферментативно), и потому что С. merolae не имеет клеточной стенки, он ведет себя так же, как протопласт в целях трансформации.[12] Для трансформации клетки кратковременно подвергаются воздействию 30% ПЭГ с интересующей ДНК, что приводит к временной трансформации.[12] В этом методе ДНК рассматривается как кольцевой элемент и не интегрируется в геном организма, поскольку не существует гомологичных областей для интеграции.

Нацеливание на гены

Чтобы создать стабильную мутантную линию, можно использовать нацеливание на ген, чтобы вставить интересующий ген в конкретное место C. merolae геном через гомологичная рекомбинация. Путем включения участков ДНК длиной в несколько сотен пар оснований на концах интересующего гена, которые комплементарны последовательности в пределах С. merolae В геноме можно использовать собственный механизм репарации ДНК организма для вставки гена в эти области.[18] Здесь можно использовать ту же процедуру трансформации, которая используется для временной экспрессии, за исключением гомологичных сегментов ДНК, чтобы обеспечить интеграцию генома.[18]

Замораживание трещин глубокое травление электронная микроскопия изображение C. merolae, показывая две клетки, в одной из которых пластида начала делиться. Предоставлено проф. Урсула Гуденаф.

Изучение деления клеток и органелл

Чрезвычайно простое деление, простая клеточная архитектура и способность синхронизировать деления в С. merolae делает его идеальным организмом для изучения механизмов деления эукариотических клеток и органелл.[3][6] Синхронизация деления органелл в культивируемых клетках может быть очень простой и обычно включает использование световых и темных циклов. Химический агент афидиколин может быть добавлен для простой и эффективной синхронизации деления хлоропластов.[19] В пероксисома механизм разделения был впервые установлен с использованием С. merolae как система,[20] где деление пероксисом можно синхронизировать с помощью микротрубочка -разрушающий препарат Оризалин в дополнение к светлым-темным циклам.[20]

Фотосинтез исследования

C. merolae также используется при исследовании фотосинтез. Примечательно, что субъединичный состав фотосистемы в С. merolae имеет некоторые существенные отличия от других родственных организмов.[21][22] Фотосистема II (PSII) из С. merolae, как и следовало ожидать, имеет особенно необычный диапазон pH, в котором он может функционировать.[21][23] Несмотря на то, что механизм ФСII требует быстрого высвобождения протонов, а растворы с более низким pH должны изменять способность делать это, С. merolae ФСII способен обменивать и расщеплять воду с той же скоростью, что и другие родственные виды.[21]

Смотрите также

внешняя ссылка

Guiry, MD; Гири, Г. (2008). "'Cyanidioschyzon merolae '". AlgaeBase. Всемирное электронное издание, Национальный университет Ирландии, Голуэй.

Рекомендации

  1. ^ «Cyanidioschyzon merolae»: новая водоросль термической кислой среды. П. Де Лука, Р. Таддеи и Л. Варано, Webbia, 1978
  2. ^ а б Де Лука П.; Taddei R; Варано Л. (1978). "Cyanidioschyzon merolae »: Новая водоросль термических кислых сред». Журнал таксономии и географии растений. 33 (1): 37–44. Дои:10.1080/00837792.1978.10670110. ISSN  0083-7792.
  3. ^ а б c d е ж Matsuzaki M; Misumi O; Шин-и Т; Маруяма С; Такахара М; Miyagishima S; Мори Т; Nishida K; Ягисава Ф; Nishida K; Ёсида Y; Нисимура Y; Nakao S; Кобаяси Т; Момояма Y; Хигасияма Т; Minoda A; Sano M; Nomoto H; Оиси К; Hayashi H; Охта F; Nishizaka S; Haga S; Miura S; Моришита Т; Kabeya Y; Терасава К; Suzuki Y; Ishii Y; Asakawa S; Takano H; Охта Н; Kuroiwa H; Tanaka K; Симидзу Н; Sugano S; Сидел на; Нодзаки H; Огасавара Н; Kohara Y; Куроива Т. (2004). "Последовательность генома сверхмалой одноклеточной красной водоросли Cyanidioschyzon merolae 10D ". Природа. 428 (6983): 653–657. Дои:10.1038 / природа02398. PMID  15071595.
  4. ^ Роберт Эдвард Ли (1999). Психология. Издательство Кембриджского университета.
  5. ^ Куроива Т; Kuroiwa H; Сакаи А; Такахаши Х; Toda K; Ито Р. (1998). «Аппарат деления пластид и митохондрий». Int. Преподобный Цитол. Международный обзор цитологии. 181: 1–41. Дои:10.1016 / s0074-7696 (08) 60415-5. ISBN  9780123645852. PMID  9522454.
  6. ^ а б Куроива (1998). "Первобытные красные водоросли Цианидий кальдарий и Cyanidioschyzon merolae как модельная система для исследования разделяющего аппарата митохондрий и пластид ». BioEssays. 20 (4): 344–354. Дои:10.1002 / (sici) 1521-1878 (199804) 20: 4 <344 :: aid-bies11> 3.0.co; 2-2.
  7. ^ а б c d е ж грамм час я j Minoda A; Сакагами Р; Ягисава Ф; Куроива Т; Танака К. (2004). "Улучшение условий культивирования и доказательства ядерной трансформации путем гомологичной рекомбинации в красной водоросли, Cyanidioschyzon merolae 10D ". Физиология растительной клетки. 45 (6): 667–671. Дои:10.1093 / pcp / pch087. PMID  15215501.
  8. ^ а б c Matsuzaki, M .; и другие. (2004). "Последовательность генома сверхмалой одноклеточной красной водоросли Cyanidioschyzon merolae 10D ". Природа. 428 (6983): 653–657. Дои:10.1038 / природа02398. PMID  15071595.
  9. ^ Барбье, Гийом; и другие. (2005). «Сравнительная геномика двух близкородственных одноклеточных термоацидофильных красных водорослей, Galdieria sulphuraria и Cyanidioschyzon merolae, Раскрывает молекулярную основу метаболической гибкости Galdieria sulphuraria и существенные различия в углеводном метаболизме обоих водорослей ». Физиология растений. 137 (2): 460–474. Дои:10.1104 / стр. 104.051169. ЧВК  1065348. PMID  15710685.
  10. ^ а б c d е ж грамм час я j k Кобаяши Y; Ohnuma M; Куроива Т; Tanaka K; Ханаока М (2010). «Основы выращивания и молекулярно-генетический анализ одноклеточной красной водоросли. Cyanidioschyzon merolae". Журнал эндоцитобиоза и клеточных исследований. 20: 53–61.
  11. ^ а б Castenholz RW; Макдермотт TR (2010). «Цианидиальные: экология, биоразнообразие и биогеография». In Seckbach J; Чепмен DJ (ред.). Красные водоросли в эпоху генома. С. 357–371.
  12. ^ а б c Ohnuma M; Ёкояма Т; Иноуэ Т; Sekine Y; Танака К. (2008). «Опосредованная полиэтиленгликолем (ПЭГ) временная экспрессия гена в красных водорослях, Cyanidioschyzon merolae 10D ". Физиология растительной клетки. 49 (1): 117–120. Дои:10,1093 / pcp / pcm157. PMID  18003671.
  13. ^ Охта, Н; Мацузаки, М; Мисуми, О; Miyagishima, S. Y .; Нодзаки, H; Танака, К; Шин-и, Т; Кохара, Y; Куроива, Т. (2003). «Полная последовательность и анализ пластидного генома одноклеточной красной водоросли Cyanidioschyzon merolae». ДНК исследования. 10 (2): 67–77. Дои:10.1093 / dnares / 10.2.67. PMID  12755171.
  14. ^ Имамура С; Yoshihara S; Накано S; Шиодзаки Н; Ямада А; Tanaka K; Такахаши Х; Asayama M; Шираи М (2003). «Очистка, характеристика и экспрессия генов всех сигма-факторов РНК-полимеразы в цианобактериях». J. Mol. Биол. 325 (5): 857–872. Дои:10.1016 / с0022-2836 (02) 01242-1. PMID  12527296.
  15. ^ Кобаяшиа Y; Канесакия Y; Танакаб А; Kuroiwac H; Kuroiwac T; Танака К. (2009). «Тетрапиррольный сигнал как координатор клеточного цикла от органелл до репликации ядерной ДНК в клетках растений». Proc. Natl. Акад. Наука. 106 (3): 803–807. Дои:10.1073 / pnas.0804270105. ЧВК  2625283. PMID  19141634.
  16. ^ Имамура С; Hanaoka M; Танака К. (2008). «Специфичный для растений белок, родственный TFIIB, PBRP, является общим фактором транскрипции для РНК-полимеразы I». EMBO J. 27 (17): 2317–2327. Дои:10.1038 / emboj.2008.151. ЧВК  2529366. PMID  18668124.
  17. ^ Ягисава Ф; Nishida K; Okano Y; Minoda A; Tanaka K; Куроива Т (2004). «Выделение устойчивых к циклогексимиду мутантов Cyanidioschyzon merolae". Цитология. 69: 97–100. Дои:10.1508 / cytologia.69.97.
  18. ^ а б Fujiwara T; Ohnuma M; Yoshida M; Куроива Т; Хирано Т. (2013). "Нацеливание генов в красных водорослях Cyanidioschyzon merolae: вставка одной или нескольких копий с использованием аутентичных и химерных маркеров выбора ". PLOS ONE. 8 (9): e73608. Дои:10.1371 / journal.pone.0073608. ЧВК  3764038. PMID  24039997.
  19. ^ Terui S; Suzuki K; Такахиаши Х; Ито Р; Куроива Т. (1995). «Высокая синхронизация деления хлоропластов в ультрамикро-водорослях. Cyanidioschyzon merolae обработкой как светом, так и афидиколином ». Дж. Фикол. 31: 958–961. Дои:10.1111 / j.0022-3646.1995.00958.x.
  20. ^ а б Имото Y; Kuroiwa H; Ёсида Y; Ohnuma M; Fujiwara T; Yoshida M; Nishida K; Ягисава Ф; Hirooka S; Miyagishima S; Misumi O; Кавано S; Куроива Т. (2013). «Одномембранно-ограниченное деление пероксисомы, выявленное путем выделения механизмов, основанных на динамине». Proc. Natl. Акад. Наука. 110 (23): 9583–9588. Дои:10.1073 / pnas.1303483110. ЧВК  3677435. PMID  23696667.
  21. ^ а б c Nilsson H; Крупник Т; Kargul J; Мессинджер Дж (2014). «Субстратный водный обмен в ядерных комплексах фотосистемы II экстремофильной красной водоросли. Cyanidioschyzon merolae". Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Биоэнергетика. 1837 (8): 1257–1262. Дои:10.1016 / j.bbabio.2014.04.001. PMID  24726350.
  22. ^ Брикер ТМ; Roose JL; Fagerlund RD; Франкель Л.К .; Итон-Рай Дж. Дж. (2012). «Внешние белки фотосистемы II». Биохим. Биофиз. Acta. 1817 (1): 121–142. Дои:10.1016 / j.bbabio.2011.07.006. PMID  21801710.
  23. ^ Крупник Т; Котабова Е; ван Безувен Л.С.; Mazur R; Гарстка М; Nixon PJ; Barber J; Kana R; Boekema EJ; Каргул Дж. (2013). "Механизм фотозащиты, зависящий от реакционного центра, в очень устойчивой фотосистеме II от экстремофильных красных водорослей, Cyanidioschyzon merolae". J. Biol. Chem. 288 (32): 23529–23542. Дои:10.1074 / jbc.m113.484659. ЧВК  5395030. PMID  23775073.