Катехолоксидаза - Catechol oxidase

Катехолоксидаза
Идентификаторы
Номер ЕС1.10.3.1
Количество CAS9002-10-2
Базы данных
IntEnzПросмотр IntEnz
БРЕНДАBRENDA запись
ExPASyПросмотр NiceZyme
КЕГГЗапись в KEGG
MetaCycметаболический путь
ПРИАМпрофиль
PDB структурыRCSB PDB PDBe PDBsum

Катехолоксидаза это медь оксидаза который содержит ди-медь типа 3 кофактор и катализирует окисление орто-дифенолы в орто-хиноны в сочетании с снижение молекулярного кислорода в воду. Он присутствует во множестве видов растений и грибов, включая Ипомея бататас (сладкий картофель )[1] и чайный куст (Индийский чайный лист).[2] Металлоферменты с медными центрами типа 3 характеризуются своей способностью обратимо связывать дикислород в условиях окружающей среды.[3] У растений катехолоксидаза играет ключевую роль в ферментативное потемнение катализируя окисление катехол в о-хинон в присутствии кислорода, который может быстро полимеризоваться с образованием меланин придает поврежденным плодам темно-коричневый цвет.

Биологическая функция

Общая реакция, катализируемая катехолоксидазой: образование двух о-хинонов и 2 молекул воды из двух молекул катехола и одной молекулы двуокиси кислорода.

Полифенолоксидазы представляют собой семейство диметаллоферментов меди, которые включают: тирозиназа и катехолоксидаза.[4] У растений оба фермента могут катализировать окисление субстратов орто-дифенолов до соответствующих им орто-хинонов. Ключевое различие между двумя родственными ферментами заключается в том, что тирозиназа может катализировать гидроксилирование монофенолов в дифенолы (активность монофенолазы), а также окисление о-дифенола до о-хинона (активность дифенолазы), тогда как катехолоксидаза обладает только дифенолазной активностью.[5]

При повреждении растительной ткани хлоропласт может разорвать и высвободить катехолоксидазу в цитоплазму растения, и вакуоли может также разорваться, высвобождая накопленный катехол в цитоплазму. Повреждение ткани также позволяет кислороду проникать в клетку. Таким образом, повреждение тканей способствует взаимодействию катехолоксидазы с ее субстратом с образованием о-бензохинона, который может полимеризовать неферментативно с образованием меланинов, которые образуют нерастворимый барьер для защиты ран.[6]

Протеолитический процессинг

Катехолоксидаза кодируется ядром, и ее N-конец содержит сигнальный пептид который направляет белок в хлоропласт тилакоид просвет, где он может быть либо растворимым, либо слабо связанным с тилакоидной мембраной.[7] Первоначально записано как профермент предшественник катехолоксидазы проходит два цикла протеолитический процессинг и транспортировать до того, как он попадет в просвет тилакоида.

Используя [35S] меченный метионином белок-предшественник, Sommer et al. выяснил путь протеолитического процессинга, общий для различных растений, включая горох (Pisum sativum), помидор (Lycopersicon esculentum) и кукурузы (Zea Mays).[8] Прекурсор 67 кДа был импортирован в строма в АТФ -зависимым образом, где стромальный пептидаза перерабатывает предшественник в промежуточное соединение 62 кДа. Транслокация этого промежуточного продукта в просвет тилакоида зависела от света и приводила к образованию зрелого фермента 59 кДа.[9] На основании анализа предшественника и зрелой катехолоксидазы, очищенной от Ипомея бататаспротеолитический процессинг удаляет как N-концевой транзитный пептид, так и C-концевой домен, который покрывает активный сайт фермента.[10]

Структура фермента

Восстановленный (Cu (I) -Cu (I)) и нативный (Cu (II) -Cu (II)) катехолоксидазный ди-медный активный центр из Ипомея батата кристаллическая структура (PDB: 1BT1, 1BT2).

В Кристальная структура катехолоксидазы, очищенной от Ипомея бататас растворяется в своей активной форме как в окисленном состоянии Cu (II) -Cu (II), так и в восстановленном состоянии Cu (I) -Cu (I).[11] Это глобулярный однодоменный мономерный фермент размером примерно 55 на 45 на 45 Å и эллипсоидной формой. Четыре α-спираль Связка включает ядро ​​фермента, которое ограничивает активный сайт, содержащий центр дигоппера.[12] Атомы азота в боковых цепях имидазола Его 88, His109 и His118 координируются с первым каталитическим ионом меди, тогда как атомы азота в боковых цепях имидазола на His240, His244 и His274 координируются со вторым каталитическим ионом меди. В окисленном состоянии Cu (II) -Cu (II) каждый ион меди обладает четырехкоординатной тригональной пирамидальной геометрией, с тремя остатками гистидина и мостиковой молекулой гидроксида, образующими четыре лиганда на каждом ионе меди. Сравнивая восстановленное (Cu (I) -Cu (I)) состояние с нативным (Cu (II) -Cu (II)) состоянием фермента, ключевым различием является расстояние между двумя центрами меди. В окисленном состоянии Cu (II) -Cu (II) расстояние Cu-Cu составляет 3,3 Å, в то время как в восстановленном состоянии Cu (I) -Cu (I) расстояние увеличивается до 4,4 Å.[1]

В то время как активный центр как тирозиназы, так и катехолоксидазы содержит ди-медный центр, вариации в соответствующей структуре каждого фермента приводят к разной активности. В катехолоксидазе a фенилаланин боковая цепь (Phe261) находится над одним из центров меди и препятствует координации подложки с обоими ионами меди в активном центре. Это исключает наличие бидентатного координационного комплекса, необходимого для гидроксилирования дифенолятов, характерного для тирозиназы, но отсутствующего у катехолоксидазы.[13] Кроме того, His109, связанный с одним из центров меди, также ковалентно связан с Cys192 через тиоэфир мост.[14] Это сшивание цистеин-гистидин может дополнительно препятствовать активному центру фермента предполагать, что бидентатный координационный комплекс легко образуется в тирозиназе.

Каталитический цикл и механизм

Предлагаемый каталитический цикл очистки катехолоксидазы от Ипомея батата.

Хотя кристаллическая структура катехолоксидазы была решена, вопросы, касающиеся точного механизма реакции, остаются. Один механизм, предложенный Eicken et al. основан на кристаллической структуре катехолоксидазы, очищенной от Ипомея бататас.[11] В каталитический цикл начинается с катехолоксидазы в ее природном окисленном состоянии Cu (II) -Cu (II) с координированным гидроксид-ионом мосты два медных центра. Когда катехол попадает в активный сайт, протон отрывается от одного из спиртов. Катехол координируется с центром Cu (II) монодентатным образом, замещая один из координирующих остатков гистидина. Координированный гидроксид-ион отводит другой протон от катехола с образованием воды, и катехол окисляется до о-хинона. Два полученных электрона восстанавливают оба медных центра до состояния Cu (I) -Cu (I). Затем дикислород связывает один медный центр, вытесняя координированную молекулу воды, а другая молекула катехола связывается с другим медным центром, вытесняя другой остаток гистидина. Это образует комплекс, в котором один медный центр имеет тетрагональную плоскую координацию с His240, His244 и молекулой дикислорода. Другой медный центр сохраняет свою первоначальную тетрагональную пирамидальную геометрию с кислородом, His88 и His118 в экваториальных положениях и His109 в аксиальном положении.[3] В этом состоянии активный центр фермента находится в тройной катехолоксидазе – O22−–Катехоловый комплекс. Два электрона передаются от подложки к кислороду с последующим разрывом связи O – O. Вода выделяется, и второй продукт о-хинона образуется вместе с восстановлением исходного состояния Cu (II) -Cu (II) для завершения каталитического цикла.[15]

Этот предложенный каталитический цикл подтверждается экспериментальным наблюдением, что стехиометрические количества о-хинона образуются после добавления катехола к ферменту, даже когда дикислород отсутствует.[15] Кроме того, как окисленное состояние Cu (II) -Cu (II), так и восстановленное состояние Cu (I) -Cu (I) были двумя состояниями, идентифицированными кристаллической структурой Ипомея бататас. Монодентатное связывание катехола с медным центром подтверждается кристаллической структурой катехолоксидазы, связанной с аналогом связанного субстрата. ингибитор фенилтиомочевина, который также монодентантно связывается с медным центром.[11] Однако одна проблема с этим каталитическим циклом заключается в том, что заряд активного центра изменяется во время каталитического цикла с +1 до +3. Это требует наличия близлежащих оснований, которые могут хранить протоны; однако рентгеновская кристаллическая структура не указывает на присутствие каких-либо таких оснований, поскольку остатки гистидина координированы с центрами меди.[16] Были предложены другие каталитические циклы, проясненные расчетами методом DFT, и кристаллические структуры, которые поддерживают одинаковый заряд в активном центре на протяжении всего цикла и, таким образом, не требуют близлежащих оснований.[15][16] Однако некоторые промежуточные соединения в предложенном цикле не согласуются с экспериментальными данными, такими как то, что стехиометрические количества о-хинона могут образовываться после добавления катехола в отсутствие кислорода.[16]

Экономическая и промышленная значимость

Окисление фенольных субстратов до соответствующих им хинонов является основной причиной потемнения фруктов и овощей во время созревания, обращения и обработки.[17] Ферментативное потемнение влияет на питательную ценность и внешний вид фруктов и продуктов. По оценкам, более половины потерь фруктов происходит в результате ферментативного потемнения, и тропические продукты особенно уязвимы для этой реакции.[6] Потеря питательных веществ может происходить из-за взаимодействия хинонов, образующихся при окислении дифенолов, с боковыми цепями незаменимые аминокислоты полученный из растительных белков. Особенно, тиол и амин функциональные группы боковых цепей аминокислот очень чувствительны к связыванию и алкилированию хинона.[18] Ключевая роль катехолоксидазы в ферментативном потемнении делает ее общей мишенью для ингибирования. Хотя существует ряд ингибирующих стратегий, таких как высокотемпературная обработка (70-90 ° C) для устранения каталитической активности катехолоксидазы,[6] популярной стратегией является снижение pH с помощью лимонная кислота. Катехолоксидаза более каталитически активна в диапазоне pH 4-8 из-за координации остатков гистидина с каталитическими центрами меди. Использование кислот, таких как лимонная кислота, для снижения pH ниже этого оптимального диапазона уменьшает связывание фермента с медью в его активном центре, поскольку протонирование остатков гистидина мешает их способности координировать свои действия с центрами меди.[19]

Искусственные ферменты

Новые подходы к дизайну искусственные ферменты на основе аминокислоты или пептиды как характерные молекулярные фрагменты привели к значительному расширению области искусственных ферментов или имитаторов ферментов. Недавние результаты группы Роба Лискэмпа показали, что скаффолдинговые остатки гистидина могут использоваться как имитаторы некоторых металлопротеины и -ферменты. Структурная мимикрия некоторых белки меди (например. гемоцианин, тирозиназа и катехолоксидаза), содержащий сайты связывания меди 3-го типа. Это значительное улучшение, поскольку использование каркасных остатков гистидина на один шаг ближе к имитации ферментов биологически релевантными видами.[20]

Рекомендации

  1. ^ а б Гердеманн С., Эйкен С., Кребс Б. (март 2002 г.). «Кристаллическая структура катехолоксидазы: новое понимание функции белков меди типа 3». Отчеты о химических исследованиях. 35 (3): 183–91. Дои:10.1021 / ar990019a. PMID  11900522.
  2. ^ Гальдер Дж, Тамули П., Бхадури А (1998). «Выделение и характеристика полифенолоксидазы из индийского чайного листа (Camellia sinensis)». Журнал пищевой биохимии. 9 (2): 75–80. Дои:10.1016 / s0955-2863 (97) 00170-8.
  3. ^ а б Коваль И.А., Гамез П., Белль С., Селмечи К., Ридейк Дж. (Сентябрь 2006 г.). «Синтетические модели активного центра катехолоксидазы: механистические исследования». Обзоры химического общества. 35 (9): 814–40. Дои:10.1039 / b516250p. PMID  16936929.
  4. ^ Дей СК, Мукерджи А (2016). «Катехолоксидаза и феноксазинон-синтаза: биомиметические функциональные модели и механистические исследования». Обзоры координационной химии. 310: 80–115. Дои:10.1016 / j.ccr.2015.11.002.
  5. ^ Гердеманн С., Эйкен С., Магрини А., Мейер Х.Э., Ромпель А., Спенер Ф., Кребс Б. (июль 2001 г.). «Изоферменты катехолоксидазы Ipomoea batatas различаются по активности, подобной каталазе». Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Структура белка и молекулярная энзимология. 1548 (1): 94–105. Дои:10.1016 / s0167-4838 (01) 00219-9. PMID  11451442.
  6. ^ а б c Queiroz C, Lopes ML, Fialho E, Valente-Mesquita VL (2008). «Полифенолоксидаза: характеристики и механизмы борьбы с потемнением». Food Reviews International. 24 (4): 361–375. Дои:10.1080/87559120802089332.
  7. ^ Марусек CM, Тробо Н.М., Flurkey WH, Inlow JK (январь 2006 г.). «Сравнительный анализ полифенолоксидазы из растений и грибов». Журнал неорганической биохимии. 100 (1): 108–23. Дои:10.1016 / j.jinorgbio.2005.10.008. PMID  16332393.
  8. ^ Sommer A, Ne'eman E, Steffens JC, Mayer AM, Harel E (август 1994). «Импорт, нацеливание и переработка растительной полифенолоксидазы». Физиология растений. 105 (4): 1301–11. Дои:10.1104 / pp.105.4.1301. ЧВК  159463. PMID  7972497.
  9. ^ Майер AM (ноябрь 2006 г.). «Полифенолоксидазы в растениях и грибах: куда пойти? Обзор». Фитохимия. 67 (21): 2318–31. Дои:10.1016 / j.phytochem.2006.08.006. PMID  16973188.
  10. ^ Flurkey WH, Inlow JK (декабрь 2008 г.). «Протеолитический процессинг полифенолоксидазы растений и грибов». Журнал неорганической биохимии. 102 (12): 2160–70. Дои:10.1016 / j.jinorgbio.2008.08.007. PMID  18829115.
  11. ^ а б c Эйкен С., Кребс Б., Саккеттини Дж. К. (декабрь 1999 г.). «Катехолоксидаза - структура и активность». Текущее мнение в структурной биологии. 9 (6): 677–83. Дои:10.1016 / s0959-440x (99) 00029-9. PMID  10607672.
  12. ^ Klabunde T, Eicken C, Sacchettini JC, Krebs B (декабрь 1998 г.). «Кристаллическая структура растительной катехолоксидазы, содержащей центр дикоппера». Структурная биология природы. 5 (12): 1084–90. Дои:10.1038/4193. PMID  9846879.
  13. ^ Лукас Х.Р., Карлин К.Д. (2009). «Глава 9: Медно-углеродные связи в механических и структурных исследованиях белков, а также в ситуациях, когда медь является каталитическим или рецепторным центром». В Sigel A, Sigel H, Sigel RK (ред.). Связи металл-углерод в ферментах и ​​кофакторах. Кембридж, Великобритания: RSC Publishing. п. 304. ISBN  978-1-84755-915-9.
  14. ^ Вирадор В.М., Рейес Граеда Дж. П., Бланко-Лабра А., Мендиола-Олайя Е., Смит Г. М., Морено А., Уитакер-младший (январь 2010 г.). «Клонирование, секвенирование, очистка и кристаллическая структура полифенолоксидазы Grenache (Vitis vinifera)». Журнал сельскохозяйственной и пищевой химии. 58 (2): 1189–201. Дои:10.1021 / jf902939q. PMID  20039636.
  15. ^ а б c Siegbahn PE (июль 2004 г.). «Каталитический цикл катехолоксидазы». Журнал биологической неорганической химии. 9 (5): 577–90. Дои:10.1007 / s00775-004-0551-2. PMID  15185133.
  16. ^ а б c Güell M, Siegbahn PE (ноябрь 2007 г.). «Теоретическое изучение каталитического механизма катехолоксидазы». Журнал биологической неорганической химии. 12 (8): 1251–64. Дои:10.1007 / s00775-007-0293-z. PMID  17891425.
  17. ^ Мартинес М., Уитакер-младший (июнь 1995 г.). «Биохимия и контроль ферментативного потемнения». Тенденции в пищевой науке и технологиях. 6 (6): 195–200. Дои:10.1016 / S0924-2244 (00) 89054-8.
  18. ^ Матезис Г., Уитакер-младший (сентябрь 1984 г.). «Модификация белков полифенолоксидазой и пероксидазой и их продуктами». Журнал пищевой биохимии. 8 (3): 137–162. Дои:10.1111 / j.1745-4514.1984.tb00322.x.
  19. ^ Йорук Р., Маршалл М.Р. (ноябрь 2003 г.). "Физико-химические свойства и функции полифенолоксидазы растений: обзор". Журнал пищевой биохимии. 27 (5): 361–422. Дои:10.1111 / j.1745-4514.2003.tb00289.x.
  20. ^ Альбада HB, Сулимани Ф, Weckhuysen BM, Лискамп Р.М. (декабрь 2007 г.). «Каркасные аминокислоты как близкий структурный имитатор сайтов связывания меди типа 3». Chemical Communications (Кембридж, Англия) (46): 4895–7. Дои:10.1039 / B709400K. PMID  18361361.

внешняя ссылка