Функциональное клонирование - Functional cloning

Рабочий процесс использования отбора в эксперименте по функциональному клонированию. Здесь только гены, обеспечивающие ампициллин сопротивление выбраны.

Функциональное клонирование это молекулярное клонирование метод, основанный на предварительном знании закодированных белок С последовательность или же функция за ген идентификация.[1][2][3] В этом анализе геномный или же библиотека кДНК проверяется на определение генетической последовательности интересующего белка. Выражение библиотеки кДНК могут быть проверены с помощью антитела специфичны для интересующего белка или могут зависеть от отбора через функцию белка.[1] Исторически аминокислотная последовательность белка использовалась для получения вырожденных олигонуклеотидов, которые затем были исследовал против библиотеки для идентификации гена, кодирующего интересующий белок.[2][3] После идентификации клонов-кандидатов, несущих интересующий ген, они последовательный и их личность подтверждена. Этот метод клонирования позволяет исследователям проверять все геномы без предварительного знания местоположения гена или генетической последовательности.[1]

Этот метод можно использовать для идентификации генов, которые кодируют похожие белки от одного организма к другому.[4] Точно так же эту технику можно сочетать с метагеномный библиотеки для идентификации новых генов и белков, которые выполняют аналогичные функции, такие как идентификация новых антибиотики путем скрининга бета-лактамаза активность или выбор для роста при наличии пенициллин.[5]

Экспериментальный рабочий процесс

Геномная библиотека в Saccharomyces cerevisiae хозяин.

Рабочий процесс эксперимента по функциональному клонированию варьируется в зависимости от источника генетического материала, степени предшествующей информации об интересующем белке или гене и способности проверять функцию белка. В общем, эксперимент по функциональному клонированию состоит из четырех этапов: 1) сбор образцов, 2) подготовка библиотеки, 3) скрининг или отбор и 4) последовательность действий.

Сбор образцов

Генетический материал собирается из определенного типа клеток, организма или образца окружающей среды, имеющего отношение к биологическому вопросу. В функциональном клонировании мРНК обычно изолирован и кДНК готовится из выделенной мРНК (Извлечение РНК ).[6] При определенных обстоятельствах геномная ДНК могут быть изолированы, особенно когда образцы окружающей среды используются в качестве источника генетического материала.[1]

Подготовка библиотеки

Смотрите также: геномная библиотека и библиотека кДНК

Если исходный материал геномная ДНК, ДНК разрезается для получения фрагментов соответствующей длины для вектор выбора. Затем фрагменты ДНК или кДНК обрабатывают эндонуклеазы рестрикции и перевязанный к плазмида или хромосомные векторы. В случае тестов, которые проводят скрининг на белок или его функцию, вектор выражения используется для обеспечения экспрессии генного продукта. Выбор вектора будет зависеть от происхождения ДНК или кДНК, чтобы гарантировать правильную экспрессию и гарантировать, что кодируемый ген будет находиться в пределах размера вставки вектора.[7]

Выбор хоста важен для того, чтобы использование кодонов будет похож на донорский организм. Хозяин также должен будет гарантировать, что посттрансляционные модификации и сворачивание белка произойдет, чтобы обеспечить правильное функционирование экспрессированных белков.[7]

Скрининг или отбор

Метод скрининга подготовленных геномных библиотек или библиотек кДНК на интересующий ген сильно варьируется в зависимости от плана эксперимента и биологического вопроса. Один из методов проверки - это зонд колонии через Саузерн-блоттинг с вырожденными олигонуклеотидами, полученными из аминокислотной последовательности запрашиваемого белка.[8] В библиотеках экспрессии интересующий белок может быть идентифицирован путем скрининга антителом, специфичным к запрашиваемому белку, через Вестерн-блоттинг для идентификации колоний, несущих интересующий ген. В других обстоятельствах для скрининга или отбора активности белка можно использовать конкретный анализ.[1] Например, гены, отвечающие за устойчивость к антибиотикам могут быть отобраны путем выращивания колоний библиотеки на средах, содержащих указанные антибиотик.[5] Другой пример - скрининг на ферментативная активность путем инкубации с субстратом, катализируемым до колориметрического соединения, которое можно легко визуализировать.[9]

Последовательность действий

Смотрите также: Секвенирование ДНК

Заключительный этап функционального клонирования - это последовательность ДНК или кДНК из клонов, которые были успешно идентифицированы на этапе скрининга или отбора. Затем последовательность можно аннотировать и использовать для последующих приложений, таких как экспрессия белка и очищение для промышленного применения.[10]

Преимущества

Преимущества функционального клонирования включают возможность скрининга новых генов с желаемым применением у организмов, которые нельзя культивировать, особенно из бактериальных или вирусных образцов.[1] Кроме того, гены, кодирующие белки со связанными функциями, могут быть идентифицированы при низком сходстве последовательностей из-за способности проводить скрининг только на функцию белка. Функциональное клонирование позволяет идентифицировать гены без предварительного знания последовательности генома организма или положения гена в геноме.[1]

Ограничения

Как и в случае с другими методами клонирования, выбор вектора и хозяина влияет на успех идентификации гена посредством функционального клонирования из-за смещения клонирования. Вектор должен иметь размер вставки, который будет вмещать всю последовательность ДНК экспрессируемого белка. Кроме того, в векторах экспрессии промоутеры и терминаторы должен функционировать в выбранном организме-хозяине. Выбор хоста может повлиять транскрипция и перевод из-за различий использование кодонов, транскрипционные и трансляционные машины или посттрансляционные модификации внутри хоста.[7][1]

Другие ограничения включают трудоемкую подготовку библиотеки и потенциальные экраны, которые могут быть дорогими и трудоемкими.[7]

Альтернативные подходы

Позиционное клонирование

Блок-схема выбора оптимальной стратегии клонирования.

Позиционное клонирование это еще один метод молекулярного клонирования для идентификации интересующего гена. Этот метод использует точное хромосомное местоположение вместо функции для определения гена.[11] Из-за этого этот метод фокусируется на всем генетическом материале хромосомного локус и не делает никаких предположений относительно функции.[11] В модельные организмы Такие как мышей или же дрожжи, этот метод используется чаще, поскольку информацию о положении интересующего гена можно получить из секвенированный геном. Однако этот метод становится более громоздким, когда информация о последовательности недоступна. В этом случае, анализ связей также можно использовать.[11] С другой стороны, функциональное клонирование чаще используется в организмах, таких как бактериальные патогены которые жизнеспособный, но некультивируемый и где данные о последовательностях недоступны, но гомология генов или функция белков все еще представляют интерес.[11]

Способ различать функциональное и позиционное клонирование - визуализировать гены в виде слов. Функциональное клонирование похоже на использование тезауруса для поиска слов и выбора новых слов, которые имеют то же значение (или функции).[12] Позиционное клонирование больше похоже на выбор определенной страницы словаря и последующий просмотр только этой страницы в поисках интересующих слов.[12]

Вычислительно определить гомологию

С появлением последовательность действий технология становится все более дешевой и дешевой, теперь стало более возможным секвенировать неизвестный геном, а затем вычислить гомология вместо скрининга.[13] Это дает дополнительное преимущество, заключающееся в возможности одновременного скрининга нескольких интересующих генов, и сокращает время эксперимента. Это также позволяет избежать трудоемких процедур клонирования.[14] Однако, если выбран этот путь, необходимо учитывать другие предубеждения и препятствия. Используя секвенированные данные, можно проводить скрининг только на основе гомологии.[1] Таким образом, основанный на функциях подход позволяет открывать новые ферменты, функции которых нельзя было бы предсказать, основываясь только на последовательности ДНК.[1] Таким образом, хотя секвенирование менее трудоемко в экспериментальном плане, оно также может привести к упущению интересующих генов из-за различной гомологии последовательностей в генах родственной функции.

Сборка Гибсона

Сборка Гибсона это метод быстрого клонирования с использованием трех основных ферментов; 5 ' экзонуклеаза, полимераза и лигаза.[15] Экзонуклеаза переваривает 5'-конец фрагмента ДНК, оставляя 3'-выступ.[15] Если есть значительная гомология (20-40 п.н.) на каждом конце вставки ДНК, она может отжигаться с комплементарной основной цепью.[15] Впоследствии полимераза может заполнить промежутки, в то время как лигаза сплавит зазубрины на конце.[15] Этот метод значительно увеличивает скорость клонирования и вероятность успешного клонирования в векторную основу.[15] Однако для этого требуется, чтобы фрагмент ДНК имел значительную гомологию с плазмидой.[15] По этой причине необходимо заранее знать клонируемую последовательность. Это не требование при функциональном клонировании.

Клонирование ТОПО

Клонирование TOPO это метод клонирования, который использует Полимераза Taq.[16] Это потому, что Taq оставляет один аденозин выступ на 3-м конце ПЦР продукты реакции.[16] Используя эти знания, позвоночник с 5-дюймовым тимин выступ можно использовать для целей клонирования.[16] В этом случае необходимо знать о клонируемом фрагменте, чтобы иметь возможность создавать для него праймеры ПЦР, а количество векторов, совместимых с клонированием TOPO, относительно невелико. Однако это дает то преимущество, что реакция занимает всего около 5 минут.[16]

Клонирование с рекомбинацией шлюза

Клонирование с рекомбинацией шлюза представляет собой метод клонирования, при котором фрагмент ДНК перемещается от одного плазмидного остова к другому с помощью одного гомологичная рекомбинация мероприятие.[17] Однако для того, чтобы этот метод работал, интересующий фрагмент ДНК должен быть фланкирован сайтами рекомбинации.[17] Хотя этот метод не является строго альтернативой, он позволяет перемещать фрагменты ДНК от одной плазмиды к другой быстрее, чем создание новой геномной библиотеки. Причина, по которой этот метод может использоваться в сочетании с функциональным клонированием, состоит в том, чтобы поместить библиотеку под другой промотор или на основу с другим маркером отбора.[17] Это может пригодиться, если человек хочет попробовать функциональное клонирование широкого спектра бактерий, чтобы попытаться решить проблему с помощью смещение кодонов.[17][7]

Приложения

Определение гомологии в окружающей среде

Метагеномика - одна из крупнейших областей, в которой обычно используется функциональное клонирование. Метагеномика изучает весь генетический материал из определенного образца окружающей среды, такого как микробиом кишечника или вода озера.[1] Функциональные библиотеки создаются, содержащие фрагменты ДНК из окружающей среды.[1] Поскольку исходную бактерию, от которой произошла последовательность ДНК, нелегко обнаружить, создание метагеномных функциональных библиотек имеет преимущества. Менее 1% всех бактерий легко культивируется в лаборатории, в результате чего остается большой процент бактерий, которые невозможно выращивать.[18] Используя функциональные библиотеки, можно еще изучить функции генов некультивируемых бактерий.[1] Кроме того, эти некультивируемые микробы служат источником для открытия новых ферментов с биотехнологическим применением. Некоторые новые белки, которые были обнаружены в морской среде, включают ферменты, такие как протеазы, амилазы, липазы, хитиназы, дезоксирибонуклеазы и фосфатазы.[19]

Определение гомологии у известных видов

Бывают ситуации, в которых необходимо определить, присутствует ли гомолог гена из одного источника в другом организме. Например, идентификация романа ДНК-полимеразы за полимеразная цепная реакция (ПЦР) реакции, при которых молекулы ДНК синтезируются из дезоксирибонуклеотидов.[20] В то время как человеческая полимераза оптимально работает при 37 ° C (98,6 ° F), ДНК не денатурирует до 94–98 ° C (201–208 ° F).[20] Это создает проблему, поскольку при этих температурах ДНК-полимераза человека будет денатурировать во время стадии денатурации реакции ПЦР, что приведет к нефункционирующему белку полимеразы и неудачной ПЦР. Для борьбы с этим ДНК-полимераза из термофил, или бактерии, которые растут при высоких температурах. Примером является Полимераза Taq который происходит от термофильных бактерий Thermus aquaticus.[20] Можно настроить функциональный экран для клонирования, чтобы найти гомологичные полимеразы, которые обладают дополнительным преимуществом в виде термостабильности при высоких температурах.

Имея это в виду, 3173-полимераза, еще один фермент полимеразы, широко используемый в настоящее время в ОТ-ПЦР реакции были обнаружены с использованием вышеупомянутой теории.[21] В реакциях ОТ-ПЦР обычно используются два отдельных фермента. Первый - ретровирус обратная транскриптаза преобразовать РНК к кДНК.[21] Второй - термостабильная ДНК-полимераза для амплификации целевой последовательности.[21] 3173 Полимераза способна выполнять обе ферментативные функции, что дает лучший вариант для ОТ-ПЦР.[21] Фермент был обнаружен с помощью функционального клонирования вирусного хозяина, первоначально обнаруженного в горячих источниках Octopus (93 ° C) в Йеллоустонском национальном парке.[21]

Приложения для здоровья человека

Одной из постоянных проблем лечения бактериальных инфекций является: устойчивость к антибиотикам которая обычно возникает, когда пациенты не принимают лекарства в полном объеме и, следовательно, позволяют бактериям со временем развить устойчивость к антибиотикам.[22] Чтобы понять, как бороться с устойчивостью к антибиотикам, важно понимать, как бактериальный геном развивается и изменяется у здоровых людей, которые в последнее время не использовали антибиотики, чтобы обеспечить исходный уровень.[22] Используя метод, основанный на функциональном клонировании, ДНК, выделенная из человека микрофлора были клонированы в векторы экспрессии в кишечная палочка.[22] После этого в качестве экрана применяли антибиотики.[22] Если плазмида содержала генную вставку, обеспечивающую устойчивость к антибиотикам, клетка выживала и отбиралась на планшете.[22] Если вставка не оказывала сопротивления, клетка погибала и не образовывала колонию.[22] На основе отбора выживших клеточных колоний была собрана лучшая картина генетических факторов, способствующих устойчивости к антибиотикам. Большинство идентифицированных генов устойчивости были ранее неизвестны.[22] Используя метод, основанный на функциональном клонировании, можно выявить гены, вызывающие устойчивость к антибиотикам, чтобы лучше понять методы лечения бактериальных инфекций.

Смотрите также

Рекомендации

  1. ^ а б c d е ж грамм час я j k л м Лам, Кэти Н .; Ченг, Цзюцзюнь; Энгель, Катя; Neufeld, Josh D .; Чарльз, Тревор С. (2015). «Текущие и будущие ресурсы для функциональной метагеномики». Границы микробиологии. 6: 1196. Дои:10.3389 / fmicb.2015.01196. ISSN  1664-302X. ЧВК  4625089. PMID  26579102.
  2. ^ а б Оксфордский словарь биохимии и молекулярной биологии. Каммак, Ричард, доктор философии (Rev. ed.). Оксфорд: Издательство Оксфордского университета. 2006 г. ISBN  9780198529170. OCLC  65467611.CS1 maint: другие (связь)
  3. ^ а б Шиндлер-Хоэн; Хон, Хольгер (01.01.2007). Анемия Фанкони: парадигматическая болезнь для понимания рака и старения. Медицинские и научные издательства Karger. ISBN  9783805582773.
  4. ^ Skjøt, M .; Kauppinen, S .; Кофод, Л .; Fuglsang, C .; Pauly, M .; Dalbøge, H .; Андерсен, Л. (2001-07-01). «Функциональное клонирование эндо-арабинаназы из Aspergillus aculeatus и ее гетерологичная экспрессия в A. oryzae и табаке». Молекулярная генетика и геномика. 265 (5): 913–921. Дои:10.1007 / s004380100489. ISSN  1617-4615.
  5. ^ а б Аллен, Хизер К.; Мо, Люк А; Родбумрер, Джицупанг; Гардер, Андра; Хандельсман, Джо (2008-10-09). «Функциональная метагеномика обнаруживает различные β-лактамазы в отдаленной почве Аляски». Журнал ISME. 3 (2): 243–251. Дои:10.1038 / ismej.2008.86. ISSN  1751-7370. PMID  18843302.
  6. ^ Shyjan, Anne M .; Хельдин, Параскеви; Мясник, Юджин С .; Ёшино, Тадаши; Брискин, Майкл Дж. (1996-09-20). «Функциональное клонирование кДНК для гиалуронансинтазы человека». Журнал биологической химии. 271 (38): 23395–23399. Дои:10.1074 / jbc.271.38.23395. ISSN  0021-9258. PMID  8798544.
  7. ^ а б c d е Лодиш, Харви; Берк, Арнольд; Зипурский, С. Лоуренс; Мацудаира, Пол; Балтимор, Дэвид; Дарнелл, Джеймс (2000). «Создание библиотек ДНК с λ-фагом и другими векторами клонирования». Цитировать журнал требует | журнал = (помощь)
  8. ^ Mølhøj, Майкл; Верма, Раджив; Райтер, Вольф-Дитер (01.07.2004). «Биосинтез d-галактуроната в растениях. Функциональное клонирование и характеристика закрепленной на мембране UDP-d-глюкуронат-4-эпимеразы из Arabidopsis». Физиология растений. 135 (3): 1221–1230. Дои:10.1104 / стр. 104.043745. ISSN  0032-0889. ЧВК  519042. PMID  15247385.
  9. ^ Ченг, Цзюцзюнь; Романцова, Татьяна; Энгель, Катя; Докси, Эндрю С .; Роуз, Дэвид Р .; Neufeld, Josh D .; Чарльз, Тревор С. (2017-03-08). «Функциональная метагеномика выявляет новые β-галактозидазы, которые нельзя предсказать по последовательностям генов». PLOS ONE. 12 (3): e0172545. Bibcode:2017PLoSO..1272545C. Дои:10.1371 / journal.pone.0172545. ISSN  1932-6203. ЧВК  5342196. PMID  28273103.
  10. ^ Вестер, Ян Кьёльхеде; Яркий, Миккель Андреас; Stougaard, Питер (2014-05-20). «Открытие новых ферментов с промышленным потенциалом в холодной и щелочной среде путем сочетания функциональной метагеномики и культивирования». Фабрики микробных клеток. 13: 72. Дои:10.1186/1475-2859-13-72. ISSN  1475-2859. ЧВК  4035831. PMID  24886068.
  11. ^ а б c d Пулити, Альдамария; Кариди, Джанлука; Раваццоло, Роберто; Гиггери, Джан Марко (01.12.2007). «Преподавание молекулярной генетики: глава 4 - позиционное клонирование генетических нарушений». Детская нефрология. 22 (12): 2023–2029. Дои:10.1007 / s00467-007-0548-5. ISSN  0931-041X. ЧВК  2908434. PMID  17661092.
  12. ^ а б Рэнд, Элизабет Б. (1998-02-01). «Генетическая основа синдрома Алажиля». Журнал детской гастроэнтерологии и питания. 26 (2): 234–236. Дои:10.1097/00005176-199802000-00024. ISSN  0277-2116.
  13. ^ Шендуре, Джей; Баласубраманян, Шанкар; Церковь, Джордж М .; Гилберт, Уолтер; Роджерс, Джейн; Schloss, Jeffery A .; Уотерстон, Роберт Х. (2017). «Секвенирование ДНК в 40 лет: прошлое, настоящее и будущее». Природа. 550 (7676): 345–353. Bibcode:2017Натура.550..345S. Дои:10.1038 / природа24286. ISSN  1476-4687. PMID  29019985.
  14. ^ «Микробное секвенирование всего генома». www.illumina.com. Получено 2018-02-27.
  15. ^ а б c d е ж Ван, Цзя-Ван; Ван, Эми; Ли, Кунью; Ван, Бангмэй; Джин, Шунцянь; Райзер, Мишель; Локки, Ричард Ф (2015). «Расщепление нуклеазой CRISPR / Cas9 в сочетании со сборкой Гибсона для бесшовного клонирования». Биотехнологии. 58 (4): 161–70. Дои:10.2144/000114261. PMID  25861928.
  16. ^ а б c d Сюй, Руцян; Циншунь, Ли Куинн (22 января 2008 г.). «Протокол: упростить клонирование генов в бинарные векторы в Agrobacterium с помощью векторной системы Gateway® TOPO». Растительные методы. 4: 4. Дои:10.1186/1746-4811-4-4. ISSN  1746-4811. ЧВК  2257932. PMID  18211693.
  17. ^ а б c d Петерсен, Лена К .; Стоуэрс, Р. Стивен (09.09.2011). «Набор средств межсетевого клонирования с рекомбинацией сайтов». PLOS ONE. 6 (9): e24531. Bibcode:2011PLoSO ... 624531P. Дои:10.1371 / journal.pone.0024531. ISSN  1932-6203. ЧВК  3170369. PMID  21931740.
  18. ^ Аманн, Рудольф (2000). «Кто там? Микробные аспекты биоразнообразия». Систематическая и прикладная микробиология. 23 (1): 1–8. Дои:10.1016 / s0723-2020 (00) 80039-9. PMID  10879972.
  19. ^ Кеннеди, Джонатан; Marchesi, Julian R .; Добсон, Алан Д.В. (21 августа 2008 г.). «Морская метагеномика: стратегии открытия новых ферментов с биотехнологическим применением из морской среды». Фабрики микробных клеток. 7: 27. Дои:10.1186/1475-2859-7-27. ISSN  1475-2859. ЧВК  2538500. PMID  18717988.
  20. ^ а б c Гарибян, Лилит; Авашиа, Нидхи (2013). "Полимеразной цепной реакции". Журнал следственной дерматологии. 133 (3): 1–4. Дои:10.1038 / jid.2013.1. ЧВК  4102308. PMID  23399825.
  21. ^ а б c d е Мозер, Майкл Дж .; ДиФранческо, Роберт А .; Говда, Кришне; Klingele, Одри Дж .; Sugar, Darby R .; Стоки, Стейси; Мид, Дэвид А .; Шенфельд, Томас В. (04.06.2012). «Термостабильная ДНК-полимераза из вирусного метагенома является мощным ферментом ОТ-ПЦР». PLOS ONE. 7 (6): e38371. Bibcode:2012PLoSO ... 738371M. Дои:10.1371 / journal.pone.0038371. ISSN  1932-6203. ЧВК  3366922. PMID  22675552.
  22. ^ а б c d е ж грамм Sommer, Morten O.A .; Дантас, Гаутам; Черч, Джордж М. (28 августа 2009 г.). «Функциональная характеристика резервуара устойчивости к антибиотикам в микрофлоре человека». Наука. 325 (5944): 1128–1131. Bibcode:2009Научный ... 325.1128С. Дои:10.1126 / science.1176950. ISSN  0036-8075. ЧВК  4720503. PMID  19713526.

внешняя ссылка