Транспластомное растение - Transplastomic plant

Примеры пластидов

А транспластомное растение это генетически модифицированное растение в котором гены инактивированы, модифицированы или новые чужеродные гены вставлены в ДНК из пластиды словно хлоропласт вместо ядерной ДНК.

В настоящее время большинство транспластомных растений являются результатом манипуляций с хлоропластами из-за плохой экспрессии в других пластиды.[1] Однако методика успешно применялась на хромопласты из помидоры.[2]

Считается, что хлоропласты в растениях возникли в результате поглощения фотосинтезирующими бактериями (цианобактериальный предок ) эукариотом.[3] Манипуляции с ДНК хлоропластов имеют много преимуществ из-за их бактериального происхождения. Например, возможность ввести несколько генов (опероны) за один шаг вместо множества шагов и одновременная экспрессия многих генов с его системой экспрессии бактериальных генов.[4] К другим преимуществам относится возможность получать такие органические продукты, как белки при высокой концентрации и тот факт, что производство этих продуктов не будет зависеть от эпигенетическая регуляция.[5]

Причина синтеза продукта в высоких концентрациях заключается в том, что одна растительная клетка потенциально может нести до 100 хлоропластов. Если все эти пластиды трансформируются, все они могут экспрессировать введенные чужеродные гены.[1] Это может быть выгодно по сравнению с трансформацией ядра, поскольку ядро ​​обычно содержит только одна или две копии гена.[1]

Преимущества, предоставляемые манипуляциями с ДНК хлоропластов, свидетельствуют о растущем интересе к этой области исследований и разработок, особенно в сельскохозяйственных и фармацевтических целях.[5] Однако есть некоторые ограничения в манипуляциях с ДНК хлоропластов, такие как невозможность манипулировать зерновые культуры Материал ДНК и плохая экспрессия чужеродной ДНК в не зеленых пластидах, как упоминалось ранее.[5] Кроме того, отсутствие посттрансляционная модификация возможность как гликозилирование в пластидах может затруднять экспрессию некоторых белков человека.[6] Тем не менее значительный прогресс был достигнут в транспластомике растений, например, в производстве съедобных вакцин для Столбняк с помощью транспластомного табак растение.[7]

Трансформация и процедура отбора

Генная конструкция

Схема кассеты растительных генов для транспластомики растений

Первое требование для создания транспластомных растений - это наличие подходящего генная конструкция который может быть введен в пластиду как хлоропласт в виде Кишечная палочка плазмида вектор.[8] Есть несколько ключевых особенностей подходящей генной кассеты, включая, помимо прочего, (1) выбираемый маркер (2) фланкирующие последовательности (3) представляющий интерес ген (4) промоторные последовательности (5) 5 'UTR (6) 3 'UTR (7) интерцистронные элементы.[9] Селективный маркер обычно представляет собой ген устойчивости к антибиотикам, который придает растительной клетке способность выдерживать рост на содержащих антибиотик агаровых чашках.[5] Фланкирующие последовательности имеют решающее значение для введения генной конструкции в точно определенные точки пластидного генома через гомологичная рекомбинация.[4] Представленный интересующий ген имеет множество различных применений и может варьироваться от генов устойчивости к вредителям до продукции вакцинного антигена.[4] Интерцистронные элементы (ИЭЭ) важны для обеспечения высоких уровней экспрессии генов, если несколько генов вводятся в форме оперон.[4] Наконец, 5 'UTR и 3' UTR усиливают связывание рибосом и повышают стабильность транскрипта соответственно.[4]

Преобразование и выбор

Наиболее распространенный метод трансформации пластид - биолистика: Маленькие частицы золота или вольфрама покрываются плазмидным вектором и проникают в молодые клетки растений или зародыши растений, проникая в несколько слоев клеток и в пластиду.[8] Тогда произойдет событие гомологичной рекомбинации между вектором дробовидной плазмиды и геном пластиды, что, как мы надеемся, приведет к стабильной вставке генной кассеты в пластиду.[8] Пока трансформация КПД ниже, чем в агробактериальный опосредованная трансформация, которая также обычна в генной инженерии растений, бомбардировка частицами особенно подходит для трансформации хлоропластов. Другие методы преобразования включают использование полиэтиленгликоль (ПЭГ) - опосредованная трансформация, которая предполагает удаление растения клеточная стенка чтобы разоблачить «голая» растительная клетка к чужеродному генетическому материалу для трансформации в присутствии ПЭГ.[8] Однако PEG-опосредованная трансформация, как известно, требует много времени, технических средств и трудозатрат, поскольку требует удаления клеточной стенки, которая является ключевым защитным структурным компонентом растительной клетки.[10] Интересно, что в статье, опубликованной в 2018 году, описана успешная пластидная трансформация хлоропласта из видов микроводорослей. N. oceanica и C. reinhardtii через электропорация.[10] Хотя исследований пластид трансформации высшие растения Используя электропорацию, это может быть интересной областью исследований в будущем.

Чтобы существовать и стабильно поддерживаться в клетке, молекула плазмидной ДНК должна содержать начало репликации, что позволяет ему реплицироваться в клетке независимо от хромосома. Когда чужеродная ДНК впервые вводится в ткань растения, не все хлоропласты успешно интегрируют введенный генетический материал.[5] Внутри растительных клеток будет смесь нормального и трансформированного хлоропласта. Эта смесь нормальных и трансформированных хлоропластов определяется как "гетероплазматический «популяция хлоропластов.[5] Стабильная экспрессия введенного гена требует "гомоплазменный «популяция трансформированных хлоропластов в растительных клетках, где все хлоропласты в растительной клетке успешно интегрировали чужеродный генетический материал.[5] Как правило, гомоплазмичность может быть достигнута и идентифицирована с помощью нескольких раундов отбора антибиотиков.[5] Здесь трансформированная растительная ткань многократно выращивается на чашках с агаром, которые содержат антибиотики, такие как спектиномицин.[5] Только клетки растений, которые успешно интегрировали генную кассету, как показано выше, будут способны экспрессировать селективный маркер устойчивости к антибиотикам и, следовательно, нормально расти на чашках с агаром, содержащих антибиотики.[5] Растение ткань которые не растут нормально, будут иметь обесцвеченный вид, так как антибиотик спектиномицин подавляет[необходимо разрешение неоднозначности ] то рибосомы в пластидах растительной клетки, тем самым предотвращая поддержание хлоропластов[5] Однако, поскольку гетероплазматическая популяция хлоропластов все еще может эффективно расти на чашках с агаром, для культивирования ткани растения, которая является гомоплазматической и стабильной, требуется множество раундов отбора антибиотиков и повторного роста.[5] Создание гомоплазматической растительной ткани считается серьезной трудностью в транспластомике и занимает невероятно много времени.[8]

Пример прививки томата в сельскохозяйственных целях

Прививка

Некоторые виды растений, такие как Nicotiana tabacum более восприимчивы к транспластомике по сравнению с представителями того же рода, такими как Никотиана глаука и Nicotiana benthamiana.[11] Эксперимент, проведенный в 2012 году, показал возможность облегчения транспластомики сложных видов растений с помощью прививка. Прививка происходит, когда два разных растения соединяются вместе и продолжают расти. Этот метод широко используется в сельском хозяйстве и даже может произойти в естественных условиях в дикой природе.[12] Транспластомный N. tabacum растение было разработано так, чтобы иметь устойчивость к спектиномицину и Флуоресценция GFP.[11] Пока ядерные трансгенные растения N. benthamiana и N. glauca были созданы, чтобы иметь канамицин устойчивость к антибиотикам и YFP флуоресценция.[11] Затем транспластомное растение и ядерные трансгенные растения прививали друг другу и затем анализировали пересаженные ткани.[11] Флуоресцентная микроскопия и отбор антибиотика на чашках с агаром как с канамицином, так и с спектиномицином, показал, что привитая растительная ткань имела как транспластомический, так и ядерный трансгенный материал ДНК.[11] Это было дополнительно подтверждено через ПЦР анализ.[11] Это исследование показало, что пластиды, такие как хлоропласт, способны проходить между клетками через соединения трансплантата и приводить к передача генетического материала между двумя разными линиями растительных клеток.[11] Это открытие имеет важное значение, поскольку оно обеспечивает альтернативный путь для создания транспластомных растений для видов, которые не так легко трансформируются с использованием нашей текущей экспериментальной методологии, как показано выше.[11]

Оптимизация экспрессии трансгена

Индуцируемое выражение такие системы как Теоретические переключатели и пентатрикопептидные повторяющиеся белки широко изучались с целью контроля и модуляции экспрессии продуктов трансгена в транспластомных растениях.[13] Одним из больших преимуществ использования индуцибельных систем экспрессии является оптимизация концентрации продукции трансгенного белка.[13] Например, молодые растения Чтобы растения стали зрелыми, необходимо тратить энергию и ресурсы на рост и развитие.[13] Учредительное выражение трансгена, следовательно, будет вредным для роста и развития растений, поскольку вместо этого он отнимает ценную энергию и ресурсы для экспрессии чужеродной генной конструкции.[13] Это привело бы к плохо развитому транспластомному растению с низким выходом продукта.[13] Индуцируемая экспрессия трансгена могла бы преодолеть это ограничение и позволить растению полностью созреть, как нормальный дикого типа растение до того, как его химически индуцируют, чтобы начать производство трансгена, который затем можно собрать.[13]

Биологическая сдержанность и сосуществование в сельском хозяйстве

Табак Nicotiana

Генетически модифицированные растения должны быть безопасными для окружающей среды и пригодными для сосуществование с традиционными и органическими культурами. Серьезным препятствием для традиционных ядерно-генетически модифицированных культур является потенциальная ауткроссинг из трансген через движение пыльцы. Первоначально считалось, что пластидная трансформация, в результате которой получают транспластомные растения, пыльца которых не содержит трансген, не только повышает биобезопасность, но также способствует сосуществованию генетически модифицированного, обычного и органического сельского хозяйства. Поэтому выращивание таких культур было основной целью исследовательских проектов, таких как Co-Extra и Трансконтейнер.

Однако исследование, проведенное на табачное растение в 2007 году опроверг эту теорию. Под руководством Ральфа Бока из Института молекулярной физиологии растений им. Макса Планка в Германии исследователи изучали генетически модифицированный табак, в котором трансген интегрирован в хлоропласты.[14] Транспластомное растение табак, полученное посредством трансформации, опосредованной хлоропластом, скрещивали с растениями, которые были стерильными с мужской стерильностью с нетронутым хлоропластом.[14] Транспластомные растения были сконструированы так, чтобы иметь сопротивление к антибиотику спектиномицин и разработан, чтобы производить молекула зеленого флуоресцентного белка (GFP).[14] Таким образом, было высказано предположение, что любое потомство, полученное от этих двух линий табака, не должно иметь возможности расти на спектиномицине или быть флуоресцентным, поскольку генетический материал в хлоропласте не должен передаваться через пыльцу.[14] Однако было обнаружено, что некоторые семена были устойчивы к антибиотику и могли прорастать на чашках с агаром со спектиномицином.[14] Расчеты показали, что 1 из каждого миллиона пыльца зерна содержали генетический материал пластид, что было бы важно в условиях сельскохозяйственной фермы.[14] Поскольку табак имеет сильную тенденцию к самооплодотворению, предполагается, что надежность транспластомных растений еще выше в полевых условиях. Таким образом, исследователи считают, что только одно из 100000000 ГМ-растений табака действительно может передавать трансген через пыльцу. Такие ценности более чем достаточны для обеспечения сосуществования. Тем не менее, для ГМ-культур, используемых в производстве фармацевтических препаратов, или в других случаях, когда недопустимо абсолютно недопустимое скрещивание, исследователи рекомендуют комбинацию трансформации хлоропластов с другими биологическое сдерживание методы, такие как цитоплазматическое мужское бесплодие или стратегии смягчения последствий трансгена. Это исследование показало, что хотя транспластомные растения не обладают абсолютной защитой генов, уровень сдерживания чрезвычайно высок и позволяет сосуществовать как обычным, так и генетически модифицированным сельскохозяйственным культурам.[14]

Общественность обеспокоена возможной передачей генов устойчивости к антибиотикам нежелательным мишеням, включая бактерии и сорняки.[15] В результате были разработаны технологии удаления селектируемого маркера гена устойчивости к антибиотикам. Одна из таких внедренных технологий - Система Cre / lox, где кодируемая ядром Cre-рекомбиназа может находиться под контролем индуцибельный промотор для удаления гена устойчивости к антибиотикам после достижения гомоплазматичности в процессе трансформации.[16]

Личинки картофельного жука

Примеры и будущее

Недавний пример транспластомики в сельском хозяйстве - защита растений картофеля от Колорадский жук.[17] Этого жука на международном уровне называют «супервредителем», потому что он сопротивление против многих инсектициды и чрезвычайно прожорливы.[17] По оценкам, только в Мичигане ежегодно жук наносит ущерб урожаю на сумму до 1,4 миллиона долларов США.[18] В исследовании, проведенном в 2015 году Чжаном, транспластомика использовалась для введения двухцепочечная РНК продуцирование трансгенов в пластидный геном.[17] Двухцепочечная РНК обеспечивает защиту трансгенного растения картофеля через РНК-интерференция методология, при которой потребление растительной ткани картофельным жуком приведет к заглушить ключевых генов, необходимых жуку для выживания.[17] Обеспечен высокий уровень защиты, листья транспластомного растения картофеля в основном не потреблялись при воздействии взрослых жуков и личинок.[17] Расследование также показало, что эффективность убийства составляет 83%. личинки который съел листья транспластомного растения.[17] В этом исследовании подчеркивается, что по мере того, как вредители приобретают устойчивость к традиционным химическим инсектицидам, использование транспластомики для реализации стратегий защиты растений с опосредованной РНКВ может стать все более жизнеспособным в будущем.[17]

Другой известный подход, основанный на транспластомике, - это производство артемизиновой кислоты с помощью транспластомных растений табако, которое является молекулой-предшественником, которую можно использовать для получения артемизинин.[19] Комбинированная терапия на основе артемизинина является предпочтительным и рекомендуемым лечением выбора ВОЗ (Всемирная организация здравоохранения) против малярия.[19] Артемизинин получают из растений. Полынь однолетняя тем не менее, только низкие концентрации артемизинина в растении могут быть получены естественным путем, и в настоящее время его не хватает для удовлетворения мирового спроса.[19] В исследовании, проведенном в 2016 году под руководством Фуэнтеса, удалось ввести путь образования артемизининовой кислоты в хлоропласт N. tabacum через биолистика перед использованием нового инструмента синтетической биологии COSTREL (combinatorial sперетрансформация транспластомический рполучатель лines) для создания транспластомного N. tabacum растение, которое имело очень высокий выход кислоты артеминизина.[20] Это исследование демонстрирует потенциальные преимущества транспластомики при био-фармацевтический приложения в будущем.

Несмотря на то, что транспластомика в настоящее время нежизнеспособна для незеленых пластид, работа по транспластомике растений, проведенная в отношении генома хлоропласта, оказалась чрезвычайно полезной.[4] Области применения трансформации хлоропластов включают, помимо прочего, сельское хозяйство, биотопливо и биофармацевтику.[4] Это происходит из-за нескольких факторов, которые включают легкость экспрессии множественных трансгенов в форме оперонов и экспрессию большого числа копий.[4] Изучение транспластомики все еще продолжается. По-прежнему необходимы дополнительные исследования и разработки для улучшения других областей, таких как транспластомика в незеленых пластидах, невозможность трансформации зерновые культуры через транспластомику и способ обойти отсутствие гликозилирование способность в хлоропласте.[4] Дальнейшие улучшения в этой области исследований дадут нам только потенциальный надежный биотехнологический путь для многих приложений, важных в нашей повседневной жизни.

Рекомендации

  1. ^ а б c Ригано М.М., Скотти Н., Карди Т. (2012-11-24). «Нерешенные проблемы трансформации пластид». Биоинженерия. 3 (6): 329–33. Дои:10.4161 / bioe.21452. ЧВК  3489708. PMID  22892591.
  2. ^ Ruf, S .; Hermann, M .; Berger, I .; Carrer, H .; Бок, Р. (2001). «Стабильная генетическая трансформация пластид томата и экспрессия чужеродного белка в плодах». Природа Биотехнологии. 19 (9): 870–875. Дои:10.1038 / nbt0901-870. PMID  11533648. S2CID  39724384.
  3. ^ Рэйвен Дж. А., Аллен Дж. Ф. (2003). «Геномика и эволюция хлоропластов: что цианобактерии сделали для растений?». Геномная биология. 4 (3): 209. Дои:10.1186 / gb-2003-4-3-209. ЧВК  153454. PMID  12620099.
  4. ^ а б c d е ж грамм час я Адем М., Бейене Д., Фейисса Т. (2017-04-01). «Последние достижения, полученные при трансформации хлоропластов». Растительные методы. 13 (1): 30. Дои:10.1186 / s13007-017-0179-1. ЧВК  5395794. PMID  28428810.
  5. ^ а б c d е ж грамм час я j k л Ахмад Н., Мишу Ф., Lössl AG, Никсон П.Дж. (ноябрь 2016 г.). «Проблемы и перспективы коммерциализации технологии трансформации пластид». Журнал экспериментальной ботаники. 67 (21): 5945–5960. Дои:10.1093 / jxb / erw360. PMID  27697788.
  6. ^ Faye, L .; Даниэлл, Х. (19 января 2006 г.). «Новые пути импорта гликопротеина в хлоропласты». Журнал биотехнологии растений. 4 (3): 275–279. Дои:10.1111 / j.1467-7652.2006.00188.x. ISSN  1467-7644. PMID  17147633.
  7. ^ Трегонинг Дж., Малига П., Дуган Дж., Никсон П. Дж. (Апрель 2004 г.). «Новые достижения в производстве вакцин для съедобных растений: хлоропластная экспрессия антигена противостолбнячной вакцины, TetC». Фитохимия. 65 (8): 989–94. Дои:10.1016 / j.phytochem.2004.03.004. PMID  15110679.
  8. ^ а б c d е Wani, Shabir H .; Хайдер, Надя; Сингх, Хитеш Кумар и Н. Б. (2010-10-31). «Завод Пластид Инжиниринг». Текущая геномика. 11 (7): 500–512. Дои:10.2174/138920210793175912. ЧВК  3048312. PMID  21532834.
  9. ^ Верма Д., Дэниэл Х (декабрь 2007 г.). «Векторные системы хлоропластов для биотехнологических приложений». Физиология растений. 145 (4): 1129–43. Дои:10.1104 / стр.107.106690. ЧВК  2151729. PMID  18056863.
  10. ^ а б Ган, Циньхуа; Цзян, Цзяоюнь; Хан, Сяо; Ван, Шифань; Лу, Янду (2018). «Разработка хлоропластного генома маслянистой морской микроводоросли Nannochloropsis oceanica». Границы растениеводства. 9: 439. Дои:10.3389 / fpls.2018.00439. ISSN  1664-462X. ЧВК  5904192. PMID  29696028.
  11. ^ а б c d е ж грамм час Стегеманн, Сандра; Кеут, Мэнди; Грейнер, Стефан; Бок, Ральф (14 февраля 2012 г.). «Горизонтальный перенос геномов хлоропластов между видами растений». Труды Национальной академии наук. 109 (7): 2434–2438. Bibcode:2012PNAS..109.2434S. Дои:10.1073 / pnas.1114076109. ISSN  0027-8424. ЧВК  3289295. PMID  22308367.
  12. ^ Гольдшмидт, Элиэзер Э. (17 декабря 2014 г.). «Прививка растений: новые механизмы, эволюционные последствия». Границы растениеводства. 5: 727. Дои:10.3389 / fpls.2014.00727. ISSN  1664-462X. ЧВК  4269114. PMID  25566298.
  13. ^ а б c d е ж Рохас, Маргарита; Юй Циго; Уильямс-Кэрриер, Розалинда; Малига, Пал; Баркан, Алиса (2019-04-29). «Сконструированные белки PPR как индуцибельные переключатели для активации экспрессии трансгенов хлоропластов». Природа Растения. 5 (5): 505–511. Дои:10.1038 / s41477-019-0412-1. ISSN  2055-0278. PMID  31036912. S2CID  139103684.
  14. ^ а б c d е ж грамм Руф С., Карчер Д., Бок Р. (апрель 2007 г.). «Определение уровня содержания трансгена, обеспечиваемого трансформацией хлоропластов». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки. 104 (17): 6998–7002. Дои:10.1073 / pnas.0700008104. ЧВК  1849964. PMID  17420459.
  15. ^ Пухта H (01.08.2003). «Безмаркерные трансгенные растения». Растительные клетки, ткани и культура органов. 74 (2): 123–134. Дои:10.1023 / А: 1023934807184. S2CID  5585801.
  16. ^ Бала А., Рой А., Дас А., Чакраборти Д., Дас С. (октябрь 2013 г.). «Разработка не содержащих селектируемых маркеров, устойчивых к насекомым, трансгенных растений горчицы (Brassica juncea) с использованием Cre / lox-опосредованной рекомбинации». BMC Biotechnology. 13 (1): 88. Дои:10.1186/1472-6750-13-88. ЧВК  3819271. PMID  24144281.
  17. ^ а б c d е ж грамм Чжан, Цзян; Хан, Шер Афзал; Хассе, Клаудиа; Руф, Стефани; Хекель, Дэвид Дж .; Бок, Ральф (27 февраля 2015 г.). «Полная защита растений от насекомых-вредителей путем экспрессии длинных двухцепочечных РНК в пластидах». Наука. 347 (6225): 991–994. Bibcode:2015Научный ... 347..991Z. Дои:10.1126 / science.1261680. ISSN  0036-8075. PMID  25722411. S2CID  206563127.
  18. ^ Графиус, Э. (1997-10-01). «Экономическое влияние устойчивости колорадского жука к инсектицидам (Coleoptera: Chrysomelidae) на картофельную промышленность штата Мичиган». Журнал экономической энтомологии. 90 (5): 1144–1151. Дои:10.1093 / jee / 90.5.1144. ISSN  0022-0493.
  19. ^ а б c Икрам, Нур К. Б. К .; Симонсен, Хенрик Т. (15.11.2017). «Обзор биотехнологического производства артемизинина в растениях». Границы растениеводства. 8: 1966. Дои:10.3389 / fpls.2017.01966. ISSN  1664-462X. ЧВК  5694819. PMID  29187859.
  20. ^ Фуэнтес, Паулина; Чжоу, Фэй; Эрбан, Александр; Керхер, Дэниел; Копка, Иоахим; Бок, Ральф (2016-06-14). «Новый подход синтетической биологии позволяет перенести весь метаболический путь от лекарственного растения к урожаю биомассы». eLife. 5: e13664. Дои:10.7554 / eLife.13664. ISSN  2050-084X. ЧВК  4907697. PMID  27296645.

внешняя ссылка

  • Co-Extra Исследования сосуществования и отслеживаемости генетически модифицированных растений
  • Трансконтейнер Разработка систем биологической защиты для генетически модифицированных растений