Гибридомная технология - Hybridoma technology

Общее представление о методе гибридомы, используемом для получения моноклональных антител.

Гибридомная технология это метод производства большого количества одинаковых антитела (также называемый моноклональные антитела ). Этот процесс начинается с введения мыши (или другого млекопитающего) антиген что вызывает иммунный ответ. Тип лейкоцитов, В клетка, продуцирует антитела, которые связываются с введенным антигеном. Эти продуцирующие антитела В-клетки затем собирают у мышей и, в свою очередь, слитный с бессмертными В-клеточными раковыми клетками, миелома,[требуется разъяснение ] производить гибрид клеточная линия называется гибридома, который обладает как способностью B-клетки продуцировать антитела, так и долговечностью и воспроизводимостью миеломы. Гибридомы можно выращивать в культуре, причем каждая культура начинается с одной жизнеспособной клетки гибридомы, продуцируя культуры, каждая из которых состоит из генетически идентичных гибридом, которые продуцируют одно антитело на культуру (моноклональные), а не смеси различных антител (поликлональные). Линия клеток миеломы, которая используется в этом процессе, выбрана по ее способности расти в культура ткани и за отсутствие синтеза антител. В отличие от поликлональные антитела, которые представляют собой смеси многих различных молекул антител, все моноклональные антитела, продуцируемые каждой линией гибридомы, являются химически идентичными.

Производство моноклональных антител было изобретено Сезар Мильштейн и Жорж Й. Ф. Кёлер в 1975 году. Они разделили Нобелевскую премию 1984 года по медицине и физиологии с Нильс Кай Йерн, которые внесли другие вклады в иммунологию. Период, термин гибридома был придуман Леонард Герценберг во время его творческого отпуска в Сезар Мильштейн лаборатория в 1976–1977 гг.[1]

Метод

(1) Иммунизация мыши
(2) Выделение В-клеток из селезенки
(3) Выращивание миеломных клеток
(4) Слияние миеломы и В-клеток
(5) Разделение клеточных линий
(6) Скрининг подходящих клеточных линий
(7) in vitro (а) или же in vivo (б) умножение
(8) Сбор урожая
Система электропорации Agile Pulse In vivo для улучшенной доставки вакцины производства BTX Harvard Apparatus, Холлистон, Массачусетс, США
BTX ECM 2001 Электрофузионный генератор для производства гибридом
Клетки гибридомы выращивают в культуре ткани. На изображении показан единственный клон клеток, каждая из которых продуцирует большие количества специфического моноклонального антитела, которое клетки секретируют и которое можно легко очистить из культуральной среды.

Лабораторные животные (млекопитающие, например мышей) сначала подвергают воздействию антигена, против которого должно быть образовано антитело. Обычно это делается серией инъекций рассматриваемого антигена в течение нескольких недель. За этими инъекциями обычно следует использование in vivo электропорация, что значительно усиливает иммунный ответ. Один раз спленоциты изолированы от млекопитающих селезенка В-клетки сливаются с иммортализованными миеломными клетками. Слияние В-клеток с миеломными клетками можно осуществить с помощью электрослияния. Электросварка заставляет В-клетки и клетки миеломы выравниваться и сливаться под действием электрического поля. В качестве альтернативы, B-клетки и миеломы можно заставить слиться с помощью химических протоколов, чаще всего с использованием полиэтиленгликоль. Клетки миеломы отбираются заранее, чтобы убедиться, что они сами не секретируют антитела и не имеют гипоксантин-гуанинфосфорибозилтрансфераза (HGPRT), что делает их чувствительными к Шляпа средняя (Смотри ниже).

Слитые клетки инкубируют в среде HAT (гипоксантин -аминоптерин -тимидин средний) примерно от 10 до 14 дней. Аминоптерин блокирует путь, который позволяет синтез нуклеотидов. Следовательно, неслитые миеломные клетки умирают, поскольку они не могут производить нуклеотиды за счет de novo или же пути спасения потому что им не хватает HGPRT. Удаление неслитых миеломных клеток необходимо, потому что они могут перерасти другие клетки, особенно слабо укоренившиеся гибридомы. Неслитые В-клетки умирают, поскольку имеют короткую продолжительность жизни. Таким образом, выживают только гибриды В-клетки и миеломы, поскольку ген HGPRT, исходящий из В-клеток, является функциональным. Эти клетки вырабатывают антитела (свойство В-клеток) и бессмертны (свойство миеломных клеток). Затем инкубированную среду разводят в многолуночных планшетах до такой степени, чтобы каждая лунка содержала только одну клетку. Поскольку антитела в лунке продуцируются одной и той же В-клеткой, они будут направлены к одному и тому же эпитопу и, следовательно, являются моноклональными антителами.

Следующим этапом является процесс быстрого первичного скрининга, который идентифицирует и отбирает только те гибридомы, которые продуцируют антитела соответствующей специфичности. Первый используемый метод скрининга называется ELISA. Затем инкубируют супернатант культуры гибридомы, конъюгат, меченный вторичным ферментом, и хромогенный субстрат, и образование окрашенного продукта указывает на положительную гибридому. Альтернативно, иммуноцитохимический,[2] Также можно использовать вестерн-блоттинг и иммунопреципитационно-масс-спектрометрический скрининг. В отличие от методов вестерн-блоттинга, иммунопреципитация-масс-спектрометрия облегчает скрининг и ранжирование клонов, которые связываются с нативными (неденатурированными) формами антигенных белков.[3]

B-клетка, продуцирующая желаемые антитела, может быть клонирована для получения множества идентичных дочерних клонов. Дополнительные носители, содержащие интерлейкин-6 (Такие как бриклон ) необходимы для этого шага. После создания гибридомной колонии она будет непрерывно расти в культуральной среде, такой как RPMI-1640 (с антибиотиками и фетальной бычьей сывороткой), и производить антитела.[2]

Многолуночные планшеты первоначально используются для выращивания гибридом, а после отбора их заменяют на более крупные колбы для тканевых культур. Это поддерживает благополучие гибридом и обеспечивает достаточное количество клеток для криоконсервации и супернатанта для последующих исследований. Супернатант культуры может давать от 1 до 60 мкг / мл моноклонального антитела, которое поддерживается при -20 ° C или ниже до тех пор, пока не потребуется.[2]

Используя культуральный супернатант или препарат очищенного иммуноглобулина, можно провести дополнительный анализ гибридомы, продуцирующей моноклональные антитела, с точки зрения реактивности, специфичности и перекрестной реактивности.[2]

Приложения

Моноклональные антитела используются во многих случаях, включая профилактику, диагностику и лечение заболеваний. Например, моноклональные антитела могут различать подмножества В-клеток и Т-клетки, что помогает идентифицировать разные типы лейкемии. Кроме того, специфические моноклональные антитела были использованы для определения маркеры клеточной поверхности на белые кровяные клетки и другие типы клеток. Это привело к кластер дифференциации серия маркеров. Их часто называют маркерами CD, и они определяют несколько сотен различных компонентов клеточной поверхности клеток, каждый из которых определяется связыванием определенного моноклонального антитела. Такие антитела чрезвычайно полезны для сортировка клеток с активацией флуоресценции, специфическая изоляция определенных типов клеток.

В диагностической гистопатологии

С помощью моноклональных антител ткани и органы можно классифицировать на основе их экспрессии определенных определенных маркеров, которые отражают тканевой или клеточный генезис. Специфический антиген простаты, плацентарная щелочная фосфатаза, хорионический гонадотропин человека, α-фетопротеин и другие - это антигены, ассоциированные с органами, и выработка моноклональных антител против этих антигенов помогает определить природу первичной опухоли.[2]

Моноклональные антитела особенно полезны для различения морфологически похожих поражений, таких как плевральный и перитонеальная мезотелиома, аденокарцинома, а также при определении органного или тканевого происхождения недифференцированных метастазы. Выбранные моноклональные антитела помогают в обнаружении скрытые метастазы (рак неизвестного первичного происхождения ) при иммуно-цитологическом анализе костного мозга, аспиратов других тканей, а также лимфатических узлов и других тканей и может иметь повышенную чувствительность по сравнению с нормой. гистопатологическое окрашивание.[2]

Одно исследование[4] провели чувствительный иммуно-гистохимический анализ Костный мозг аспираты 20 пациентов с локализованным раком простаты. В анализе использовали три моноклональных антитела (T16, C26 и AE-1), способные распознавать мембранные и цитоскелетные антигены, экспрессируемые эпителиальными клетками, для обнаружения опухолевых клеток. Аспират костного мозга у 22% пациентов с локализованным раком простаты (стадия B, 0/5; стадия C, 2/4) и у 36% пациентов с метастатическим раком простаты (стадия D1, 0/7 пациентов; стадия D2, 4 / 4 пациента) имели антиген-положительные клетки в костном мозге. Был сделан вывод, что иммуно-гистохимическое окрашивание аспиратов костного мозга очень полезно для обнаружения скрытых метастазов в костном мозге у пациентов с явно локализованным раком простаты.

Хотя иммуно-цитохимия с использованием моноклональных антител, связанных с опухолью, привела к улучшенной способности обнаруживать скрытые рак молочной железы клеток в аспирате костного мозга и периферической крови, необходимо дальнейшее развитие этого метода, прежде чем его можно будет использовать в повседневной практике.[5] Одним из основных недостатков иммуно-цитохимии является то, что используются только опухоль-ассоциированные, а не опухолеспецифические моноклональные антитела, и в результате может иметь место некоторая перекрестная реакция с нормальными клетками.[6]

Чтобы эффективно определить стадию рака груди и оценить эффективность режимов очистки перед инфузией аутологичных стволовых клеток, важно обнаружить даже небольшое количество клеток рака груди. Иммуно-гистохимические методы идеально подходят для этой цели, поскольку они просты, чувствительны и довольно специфичны. Франклин и др.[7] провели чувствительный иммуно-цитохимический анализ с использованием комбинации четырех моноклональных антител (260F9, 520C9, 317G5 и BrE-3) против гликопротеинов на поверхности опухолевых клеток для идентификации опухолевых клеток груди в костном мозге и периферической крови. На основании результатов они пришли к выводу, что иммуно-цитохимическое окрашивание костного мозга и периферическая кровь это чувствительный и простой способ обнаружения и количественного определения клеток рака груди.

Одна из основных причин метастатический рецидив у пациентов с солидные опухоли это раннее распространение злокачественных клеток. Использование моноклональных антител (mAb), специфичных к цитокератинам, может идентифицировать диссеминированные отдельные эпителиальные опухолевые клетки в костном мозге.

Одно исследование[8] сообщает о разработке иммуно-цитохимической процедуры для одновременной маркировки цитокератинового компонента № 18 (CK18) и специфический антиген простаты (PSA). Это поможет в дальнейшей характеристике диссеминированных отдельных эпителиальных опухолевых клеток у пациентов с раком простаты. Двенадцать контрольных аспиратов от пациентов с доброкачественной гипертрофией предстательной железы показали отрицательное окрашивание, что дополнительно подтверждает специфичность СК18 в обнаружении эпителиальных опухолевых клеток в костном мозге.

В большинстве случаев злокачественное заболевание, осложненное излинием, неопластические клетки можно легко узнать. Однако в некоторых случаях злокачественные клетки не так легко увидеть или их присутствие слишком сомнительно, чтобы назвать это положительным результатом. Использование иммуно-цитохимических методов повышает точность диагностики в этих случаях.

Гош, Мейсон и Сприггс[9] проанализировали 53 образца плевральной или перитонеальной жидкости от 41 пациента со злокачественным заболеванием. Обычное цитологическое исследование не выявило опухолевых клеток. Три моноклональных антитела (анти-CEA, Ca 1 и HMFG-2) были использованы для поиска злокачественных клеток. Иммуноцитохимическое маркирование проводилось на неокрашенных мазках, которые хранились при -20 ° C до 18 месяцев. В двенадцати из сорока одного случая иммуноцитохимического окрашивания были выявлены злокачественные клетки. Результатом стало увеличение диагностическая точность примерно 20%. В исследовании сделан вывод о том, что у пациентов с подозрением на злокачественное заболевание иммуно-цитохимическая маркировка должна использоваться в повседневной практике при исследовании цитологически отрицательных образцов и имеет важное значение для ведения пациентов.

Другое применение иммуноцитохимического окрашивания - обнаружение двух антигенов в одном мазке. Двойное окрашивание антителами к легкой цепи и маркерами Т- и В-клеток может указывать на неопластическое происхождение лимфомы.[10]

В одном исследовании сообщалось о выделении клеточной линии гибридомы (клон 1E10), которая продуцирует моноклональные антитела (IgM, изотип k). Это моноклональное антитело показывает специфическое иммуно-цитохимическое окрашивание ядрышек.[11]

С помощью моноклональных антител можно классифицировать ткани и опухоли на основе экспрессии в них определенных маркеров. Они помогают различать морфологически похожие поражения и определять органное или тканевое происхождение недифференцированных метастазов. Иммуно-цитологический анализ костного мозга, тканевых аспиратов, лимфатических узлов и т. Д. С использованием отдельных моноклональных антител помогает в обнаружении скрытых метастазов. Моноклональные антитела повышают чувствительность при обнаружении даже небольших количеств инвазивных или метастатических клеток. Моноклональные антитела (mAb), специфичные для цитокератинов, могут обнаруживать диссеминированные отдельные эпителиальные опухолевые клетки в костном мозге.

Рекомендации

  1. ^ Мильштейн, C (1999). «Гибридомная революция: ответвление фундаментальных исследований». BioEssays. 21 (11): 966–73. Дои:10.1002 / (SICI) 1521-1878 (199911) 21:11 <966 :: AID-BIES9> 3.0.CO; 2-Z. PMID  10517870.
  2. ^ а б c d е ж Нельсон, П.Н. Рейнольдс, GM; Waldron, EE; Уорд, E; Giannopoulos, K; Мюррей, PG (2000). «Демистифицировано ...: Моноклональные антитела». Молекулярная патология. 53 (3): 111–7. Дои:10.1136 / mp.53.3.111. ЧВК  1186915. PMID  10897328.
  3. ^ Корбакис, Д; Brinc, D; Schiza, C; Soosaipillai, A; Ярви, К; Драбович А.П .; Диамандис, Э (2015). «Скрининг мониторинга реакций, выбранных с помощью иммунозахвата, облегчает разработку ELISA для измерения нативного TEX101 в биологических жидкостях». Молекулярная и клеточная протеомика. 14 (6): 1517–1526. Дои:10.1074 / mcp.M114.047571. ЧВК  4458717. PMID  25813379.
  4. ^ Бреттон, PR; Меламед, MR; Ярмарка, WR; Кот, RJ (1994). «Обнаружение скрытых микрометастазов в Костный мозг больных карциномой простаты ». Предстательная железа. 25 (2): 108–14. Дои:10.1002 / pros.2990250208. PMID  7518596.
  5. ^ Квалхейм, G (1996). «Обнаружение скрытых опухолевых клеток в костном мозге и крови у больных раком груди - методы и клиническое значение». Acta Oncol. 35: 13–18. Дои:10.3109/02841869609098516. PMID  9073044.
  6. ^ Квалхейм, Г. (1998). «Диагностика минимальной остаточной болезни костного мозга и крови у онкологических больных - методы и клиническое значение». Acta Oncologica. 37 (5): 455–62. Дои:10.1080/028418698430403. PMID  9831374.
  7. ^ Франклин, Вашингтон; Shpall, EJ; Арчер, П; Джонстон, CS; Гарза-Уильямс, S; Хами, L; Горький, Массачусетс; Bast, RC; Джонс, РБ (1996). «Иммуноцитохимическое обнаружение клеток рака груди в костном мозге и периферической крови пациентов, проходящих химиотерапию высокими дозами с использованием аутологичных стволовых клеток». Лечение рака груди Res. 41 (1): 1–13. Дои:10.1007 / BF01807031. PMID  8932871.
  8. ^ Ризенберг, Р; Обернедер, Р. Kriegmair, M; Эпп, М; Bitzer, U; Hofstetter, A; Браун, S; Riethmüller, G; Пантель, К. (1993). «Иммуноцитохимическое двойное окрашивание цитокератина и простатического специфического антигена в индивидуальных опухолевых клетках простаты». Гистохимия. 99 (1): 61–6. Дои:10.1007 / BF00268022. PMID  7682210.
  9. ^ Гош, AK; Мейсон, Д. Й; Сприггс, А.И. (1983). «Иммуноцитохимическое окрашивание моноклональными антителами в цитологически« отрицательных »серозных выпотах больных злокачественными новообразованиями». Дж. Клин Патол. 36 (10): 1150–53. Дои:10.1136 / jcp.36.10.1150. ЧВК  498493. PMID  6194182.
  10. ^ Гош, AK; Сприггс, AI; Тейлор-Пападимитриу, Дж.; Мейсон, Д. Ю. (1983). «Иммуноцитохимическое окрашивание клеток плеврального и перитонеального выпота с панелью моноклональных антител». Дж. Клин Патол. 36 (10): 1154–64. Дои:10.1136 / jcp.36.10.1154. ЧВК  498494. PMID  6194183.
  11. ^ Vissers, CJ; Flohil, CC; Де Йонг, AA; Диндженс, Вашингтон; Босман, FT (1996). «Новое моноклональное антитело для специфического иммуноцитохимического окрашивания ядрышек». Acta histochemica. 98 (2): 113–21. Дои:10.1016 / S0065-1281 (96) 80028-6. PMID  8739296.

внешняя ссылка