Галактозооксидаза - Википедия - Galactose oxidase

Галактозооксидаза
1gog.jpg
Кристаллическая структура галактозооксидазы с тремя доменами: домен 1 (синий), домен 2 (зеленый) и домен 3 (красный)
Идентификаторы
Номер ЕС1.1.3.9
Количество CAS9028-79-9
Базы данных
IntEnzПросмотр IntEnz
БРЕНДАBRENDA запись
ExPASyПросмотр NiceZyme
КЕГГЗапись в KEGG
MetaCycметаболический путь
ПРИАМпрофиль
PDB структурыRCSB PDB PDBe PDBsum
Генная онтологияAmiGO / QuickGO

Галактозооксидаза (D-галактоза: кислород-6-оксидоредуктаза, D-галактозооксидаза, бета-галактозооксидаза; сокращенный GAO, GAOX, GOase; EC 1.1.3.9 ) является фермент что катализирует окисление из D-галактоза у некоторых видов грибы.[1][2]

Галактозооксидаза принадлежит к семейству оксидоредуктазы. Ион меди требуется в качестве кофактор для оксидазы галактозы. Замечательная особенность галактозооксидазы заключается в том, что это свободный радикал фермент.[3][4] Его каталитический центр содержит свободный радикал лиганд согласование с медным центром.[4] Этот свободнорадикальный лиганд представляет собой ковалентно сшитый цистеин и тирозин боковые цепи, образующиеся во время посттрансляционная модификация.[3][4]

Фон

Встречается у нескольких видов грибов, таких как Fusarium graminearum NRRL 2903 (ранее ошибочно идентифицировано как Dactylium dendroides),[5] и другие виды Фузариум и Аспергиллы роды,[1] галактозооксидаза была впервые выделена в 1959 году.[6] Этот фермент секретируется грибами для работы во внеклеточном пространстве.[1][3][7] Хотя реакция окисления D-галактозы дает название галактозооксидазе, сопряженное восстановление дикислород к пероксид водорода считается, что имеет большее физиологическое значение для дрожжей.[3][4] Перекись водорода, производимая дрожжами таким образом, возможно, бактериостатический агент.[3]

Белковая структура

Галактозооксидаза содержит 639 аминокислоты.[1] Это сингл пептид мономер который имеет три β-структурных домены.[1][7] Домен 1 (остатки 1-155) представляет собой β-бутерброд состоящий из восьми антипараллельных β-тяжи.[3] Он содержит возможный сайт связывания Na+ или Ca2+, которые могут выполнять структурные роли в белке.[3] Другой особенностью домена 1 является наличие сайта связывания углеводов, который направляет фермент на связывание с внеклеточными углеводами.[3] Домен 2 (остатки 156-552) содержит сайт связывания меди.[1] Β-тяжи в Домене 2 организованы как семикратный пропеллер,[1] и каждая из семи структурных единиц представляет собой субдомен, состоящий из четырех антипараллельных β-цепей.[3] Домен 3 (остатки 553-639) состоит из семи антипараллельных β-цепей и образует «кэп» над Доменом 2. Один гистидин (His581) домена 3 служит лиганд для меди, вносящей вклад в металлсодержащий активный центр фермента.[1]

Активный сайт

Показана структура активного центра галактозоксидазы с координирующими лигандами. Индольное кольцо Trp290 образует «щит», защищающий активный центр. Обратите внимание на удлиненную связь медь-растворитель.

Галактозооксидаза - это белок меди типа II.[1][8] Он содержит единственный медный центр, который имеет квадратную плоскость или пирамидальную квадратную основу. координационная геометрия.[3][4][9] Медный центр имеет пять координирующих лигандов: два тирозины (Tyr272 и Tyr495), два гистидины (His496 и His581) и молекула растворителя, которой обычно является вода.[3][4] Медь в активном центре галактозоксидазы описывается как имеющая «искаженную квадратно-пирамидальную» координационную геометрию.[3][4] Tyr495 - аксиальный лиганд, остальные четыре лиганда лежат примерно в одной плоскости. Оба гистидина координируются с медью через 3-азот.[3] Медь-H2О облигация самая длинная координационная связь;[3][4] это лабильный и может быть заменен молекулой субстрата. Tyr272 образует димер с цистеином (Cys228) через ортоуглерод тирозина и атом серы цистеина, который поддерживается Рентгеновская кристаллография исследования.[1][3][4][10] Сшивка Tyr-Cys снижает структурную гибкость Tyr272.[3] Этот поперечно-сшитый тирозинат также является свободным радикалом. В полностью окисленной форме галактозоксидазы свободные радикалы связываются с центром меди (II). антиферромагнитно, при поддержке Спектроскопические исследования ЭПР.[4][6] Более того, образование сшивающих тиоэфирная связь считается, что снижает окислительный потенциал из Tyr272 феноксид, что делает этот феноксил более легко окисляемым с образованием радикала в посттрансляционной модификации.[1][3][8]

Свободный радикал в галактозооксидазе необычайно стабилен по сравнению со многими другими свободными радикалами белка.[2][3] Свободнорадикальный лиганд стабилизируется в основном двумя способами. Во-первых, как показал вычислительная химия исследования, неспаренный электрон стабилизируется через делокализация посредством ароматическое кольцо тирозина и сшитой цистеиновой серы, при этом атом кислорода Tyr272 обладает высокой непарной электронная плотность.[1][4][9] Некоторые экспериментальные данные также подтверждают, что аксиальный Tyr495 также участвует в делокализации неспаренных электронов.[3] Во-вторых, индол кольцо триптофан (Trp290) расположен выше и параллельно тирозин-цистеину, ведя себя как щит, защищающий радикал от внешней среды растворителя.[1][3][4] Подтверждающие доказательства исходят из этого мутация этого остатка триптофана приводит к более низкой стабильности активной формы оксидазы галактозы.[3] Кроме того, внешняя сфера активного центра состоит из многих ароматических остатков, которые придают активному центру гидрофобный персонаж.[3] Есть также обширные водородная связь сети окружают активный сайт.[3]

Реакция

В дрожжах галактозооксидаза катализирует следующую реакцию:[1][4]

D-галактоза + O2 D-галакто-гексодиалдоза + H2О2

Эта реакция по сути является окислением первичного алкоголь с помощью дикислород сформировать соответствующий альдегид и пероксид водорода.[1][4] Было показано, что галактозооксидаза также способна катализировать различные первичные спирты, кроме галактозы.[2][3] Фактически, галактозооксидаза катализирует дигидроксиацетон в три раза быстрее, чем с галактозой.[3] Реакция региоселективный, в том, что он не может окислять вторичный спирт.[3]

Это двухэлектронное окисление достигается за счет двойного окислительно-восстановительного центра: металлического центра меди (II) и свободного радикала, каждый из которых способен принимать один электрон от подложки.[4] Этот двойной окислительно-восстановительный центр имеет три доступных уровня окисления.[4] В каталитическом цикле галактозоксидазы фермент перемещается между полностью окисленной формой и полностью восстановленной формой.[4] Полуокисленная форма - это неактивная форма.

Редокс-схема GAOX и три степени окисления

Каталитический механизм

Принятый каталитический механизм, называемый «механизмом пинг-понга», состоит из четырех основных стадий.[1][4][9][11] Первый этап - окисление субстрата двойным окислительно-восстановительным центром. После гидроксил группа субстрата спирта занимает координационный центр растворителя, гидроксильная группа депротонируется с помощью Tyr495 с последующим высвобождением Tyr495.[12][1] Этот шаг делает спирт более склонным к окислению.[4] Протон на углероде, к которому раньше присоединялась гидроксильная группа, затем переносится на Tyr272 (служащий акцептором водорода) в сочетании с окислением субстрата. Один электрон переходит к радикальному лиганду, другой - к центру меди (II), который затем восстанавливается до меди (I). Между тем, радикал Tyr272 также восстанавливается.[4] Шаг вычитания протонов определение ставки и стереоспецифический так как только pro-S водород на углероде спирта удаляется (подтверждено исследованиями его кинетического изотопного эффекта).[1][3][4] Общий результат этапа 1 - удаление двух атомов водорода и двух электронов с подложки, порядок которых, однако, неясен.[1][4] Второй этап - это высвобождение окисленного субстрата (в данном случае альдегида) и координация молекулярного кислорода в координационном центре субстрата. На третьей стадии дикислород быстро восстанавливается медью (I) с образованием супероксид. Супероксид - это химически активный компонент, который вычитает протон и электрон из Tyr272 и повторно формирует тирозиновый радикал. На четвертой стадии гидропероксид депротонирует Tyr496 и выделяется в виде H2О2. Последующая аксиальная координация Tyr496 и экваториальная координация новой молекулы субстрата к медному центру завершают оборот фермента.

Каталитический механизм галактозооксидазы

Посттрансляционная модификация

Препро -GAOX (галактозоксидаза с сигнальной последовательностью) дважды обрабатывается протеолитическое расщепление в лидерная последовательность с образованием зрелого пептида GAOX (про-GAOX).[3] Первое расщепление удаляет последовательность из 24 аминокислот путем сигнальная пептидаза.[3] Второе расщепление удаляет еще одну последовательность из 17 аминокислот.[3]

Ковалентная связь между Tyr272 и Cys228 образуется после профи -GAOX был сделан.[4] Появление этой модификации, по-видимому, не требует каких-либо других «вспомогательных» белков.[3][10] Текущий механизм образования этой ковалентной связи предполагает потребность в меди (I) и дикислороде.[3][4] Механизм этой тирозин-цистеиновой связи до конца не изучен, но несколько ключевых событий были предсказаны:[1] медь (I) координируется с Tyr272 и гистидинами в (будущем) активном центре. Реакция двуокиси кислорода с комплексом активного центра приводит к образованию свободных радикалов. средний. Две возможные формы свободного радикала, тиил и феноксил, возможны;[3] присоединение тиильного радикала к фенолу или присоединение феноксильного радикала к тиолу создает ковалентную связь между атомом серы цистеина и ароматическим кольцом тирозина;[2] Вторая молекула диоксида реагирует с центром меди, координированным с поперечно-сшитым тирозин-цистеином, с образованием комплекса радикал-медь.[3][4]

Приложения

Биоанализ

Биомолекулы в образцах, таких как галактоза, можно количественно определить с помощью метода обнаружения кислорода, поскольку один эквивалент потребления кислорода соответствует одному эквиваленту окисленной первичной гидроксильной группы.[3] Образование перекиси водорода при окислении субстрата также может быть использовано для колориметрический обнаружение галактозы с помощью красителей, окисляемых перекисью водорода.[3] Поскольку углеводы обычно могут иметь первичные гидроксильные группы, галактозооксидаза может использоваться для модификации клеточной поверхности. гликопротеины для достижения маркировки ячеек.[3]

Органический синтез

Галактозооксидаза использовалась в качестве биокатализатор в синтезе альдегиды и карбоновые кислоты из первичных спиртов.[3]

Биомиметические соединения

Наше понимание механизма галактозооксидазы вдохновляет исследователей на разработку модельных соединений, имитирующих структуру и функцию галактозооксидазы.[4] Похоже, что обмен электронами между медью и свободным радикалом является решающим элементом в успехе синтеза этих соединений.[4] Первым модельным составом GAOX является [Cu (II) (dnc)], в котором используется дункамин (dnc) как хелатирующий лиганд.[3] Другие модельные соединения были изучены и описаны в литературе.[6][8][9][13][14]

Рекомендации

  1. ^ а б c d е ж грамм час я j k л м п о п q р s т Бертини I, Сигель А, Сигель Х, ред. (2001). Справочник по металлопротеинам. Нью-Йорк, штат Нью-Йорк [u.a.]: Деккер. ISBN  978-0824705206.
  2. ^ а б c d Ткац Дж., Востиар И., Гемайнер П., Стурдик Э. (май 2002 г.). «Косвенное свидетельство прямой электронной связи между активным центром галактозооксидазы и графитовым электродом». Биоэлектрохимия. 56 (1–2): 23–5. Дои:10.1016 / с1567-5394 (02) 00043-9. PMID  12009437.
  3. ^ а б c d е ж грамм час я j k л м п о п q р s т ты v ш Икс у z аа ab ac объявление ае аф аг ах ай эй ак аль являюсь Уиттакер JW (2002). «Галактозооксидаза». Достижения в химии белков. 60: 1–49. Дои:10.1016 / с0065-3233 (02) 60050-6. ISBN  9780120342600. PMID  12418174.
  4. ^ а б c d е ж грамм час я j k л м п о п q р s т ты v ш Икс у z аа Бертини I, Грей HB, Штифель Э.И., Валентайн JS, ред. (2006). Биологическая неорганическая химия: структура и реакционная способность. Саусалито, Калифорния: Университетские научные книги. ISBN  978-1891389436.
  5. ^ Ögel Z (апрель 1994). «Споруляция, вызванная целлюлозой, у гриба, продуцирующего галактозоксидазу, Cladobotryum (Dactylium) dendroides NRRL 2903, и его повторная идентификация как разновидность Fusarium». Микологические исследования. 98 (4): 474–480. Дои:10.1016 / S0953-7562 (09) 81207-0.
  6. ^ а б c Ван И, Stack TD (январь 1996 г.). "Модельные комплексы галактозооксидазы: каталитическая активность". Журнал Американского химического общества. 118 (51): 13097–13098. Дои:10.1021 / ja9621354.
  7. ^ а б Барон А.Дж., Стивенс С., Уилмот С., Сеневиратн К.Д., Блейкли В., Дули Д.М., Филлипс С.Е., Ноулз П.Ф., Макферсон М.Дж. (октябрь 1994 г.). «Строение и механизм галактозоксидазы. Свободнорадикальный сайт». Журнал биологической химии. 269 (40): 25095–105. PMID  7929198.
  8. ^ а б c Wendt F, Rolff M, Thimm W, Näther C, Tuczek F (ноябрь 2013 г.). «Модель системы малых молекул галактозооксидазы: геометрия, реакционная способность и электронная структура». Zeitschrift für Anorganische und Allgemeine Chemie. 639 (14): 2502–2509. Дои:10.1002 / zaac.201300475.
  9. ^ а б c d Гамез П., Коваль И.А., Ридейк Дж. (Декабрь 2004 г.). «Биологически имитирующие галактозооксидазу и гемоцианин, два белка меди, перерабатывающих кислород». Dalton Transactions (24): 4079–88. Дои:10.1039 / b413535k. PMID  15573156.
  10. ^ а б Ито Н., Филлипс С.Е., Стивенс С., Огель З. Б., Макферсон М. Дж., Кин Дж. Н., Ядав К. Д., Ноулз П. Ф. (март 1991 г.). «Новая тиоэфирная связь, обнаруженная кристаллической структурой 1,7А галактозооксидазы». Природа. 350 (6313): 87–90. Дои:10.1038 / 350087a0. PMID  2002850. S2CID  4345713.
  11. ^ Himo F, Siegbahn PE (июнь 2003 г.). «Квантово-химические исследования радикалсодержащих ферментов». Химические обзоры. 103 (6): 2421–56. Дои:10.1021 / cr020436s. PMID  12797836.
  12. ^ Уиттакер JW (июнь 2003 г.). «Свободнорадикальный катализ галактозоксидазой». Химические обзоры. 103 (6): 2347–63. Дои:10.1021 / cr020425z. PMID  12797833.
  13. ^ Таки М., Кумей Х., Нагатомо С., Китагава Т., Ито С., Фукузуми С. (апрель 2000 г.). «Модели активных центров галактозооксидазы, содержащие две разные фенольные группы». Неорганика Chimica Acta. 300-302: 622–632. Дои:10.1016 / S0020-1693 (99) 00579-4.
  14. ^ Ван И, Дюбуа Дж. Л., Хедман Б., Ходжсон К. О., Стек TD (январь 1998 г.). «Каталитические модели галактозооксидазы: биомиметическая реакционная способность Cu (II) -феноксил-радикала». Наука. 279 (5350): 537–40. Bibcode:1998Sci ... 279..537W. Дои:10.1126 / science.279.5350.537. PMID  9438841.