N-ацилфосфатидилэтаноламин-специфическая фосфолипаза D - N-acyl phosphatidylethanolamine-specific phospholipase D

N-ацилфосфатидилэтаноламинфосфолипаза D
Идентификаторы
СимволНАПЕПЛД
Ген NCBI222236
HGNC21683
OMIM612334
PDB4QN9
RefSeqNM_001122838
UniProtQ6IQ20
Прочие данные
Номер ЕС3.1.4.54
LocusChr. 7 q22.1

N-ацилфосфатидилэтаноламинфосфолипаза D (НАПЭ-ПЛД) является фермент что катализирует высвобождение N-ацилэтаноламин (NAE) из N-ацил-фосфатидилэтаноламин (НАПЕ). Это основная часть процесса преобразования обычных липиды в химические сигналы, такие как анандамид и олеоилэтаноламин. У человека белок NAPE-PLD кодируется НАПЕПЛД ген.[1][2][3][4]

Открытие

NAPE-PLD - это фермент активность - а фосфолипаза, действующий на фосфолипиды найдено в клеточная мембрана. Это не так гомология но химический результат его деятельности, который классифицирует его как фосфолипаза D. Ферментативная активность была обнаружена и охарактеризована в серии экспериментов, завершившихся публикацией в 2004 г. схемы биохимической очистки, из которой пептидное секвенирование может быть выполнено.[2] Исследователи гомогенизированный (мелко измельченные) сердца от 150 крыс и подвергали полученному сырой лизат к осаждение сахарозы при 105000 х г, чтобы отделить клеточные мембраны от остальной части клетки. В интегральные мембранные белки были тогда солюбилизированный с помощью октилглюкозид и подвергся четырем колоночная хроматография шаги (катионообменная колонка HiTrap SP HP, анионообменная колонка HiTrap Q, аффинная колонка HiTrap Blue, колонка с гидроксиапатитом Bio-Gel HTP). Каждый из них разделяет разные типы мембранных белков в разные контейнеры для образцов, когда белки элюированный из колонки с течением времени, и измеряя активность образцов в каждом контейнере, можно было отслеживать, какие из них получили активный фермент. Измерение активности фермента было выполнено тонкослойная хроматография радиоактивного субстрат чувствительность к ферментативной активности NAPE-PLD: расщепление субстрата затронуло место его появления на пластине, когда излучение было обнаружено на анализаторе биоимиджинга.

Результатом этой обширной процедуры все еще не был чистый белок, но он давал ограниченное количество полос. SDS-СТРАНИЦА, и одна полоса из 46 килодальтон было обнаружено, что интенсивность коррелирует с ферментативной активностью. Эту полосу вырезали из геля и переваривали трипсин, а пептиды из него отделялись друг от друга обращенно-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография. Затем полученные фрагменты подвергали микросеквенированию с помощью автоматизированного Эдман деградация.[5] Три соответствовали виментин, промежуточная нить белок 56 кДа считался загрязняющим, а два других соответствовали клону кДНК, впоследствии идентифицированному как NAPE-PLD.

Как только этот ключ был получен, идентификация могла быть подтверждена менее обременительной процедурой: сверхэкспрессия предполагаемой кДНК NAPE-PLD в COS-7 клетки показал сильную ферментативную активность NAPE-PLD, характеристики которой, как было показано, были аналогичны характеристикам исходного экстракта сердца.[2]

Характеристики

В НАПЕПЛД кДНК последовательность предсказывает 396 аминокислота последовательности как у мышей, так и у крыс, которые на 89% и 90% идентичны таковым человека.[2] Было обнаружено, что NAPE-PLD не имеет гомологии с известными фосфолипаза D гены, но по гомологии могут быть классифицированы как попадающие в цинк металлогидролаза семья бета-лактамазная складка. В частности, высококонсервативный мотив ЧАС ИКС(E /ЧАС )ИКСD (C /р /S /ЧАС )ИКС50–70ЧАС Икс15–30(C /S /D )ИКС30–70ЧАС наблюдалось, что в целом связано с цинк привязка и гидролиз реакция в этом классе белков, что привело авторов к предположению, что активность должна коррелировать с содержанием цинка.

Когда рекомбинантный NAPE-PLD был протестирован в клетках COS in vitro он имел аналогичную активность в отношении нескольких радиоактивно меченый субстраты: N-пальмитоилфосфатидилэтаноламин, N-арахидоноилфосфатидилэтаноламин, N-олеоилфосфатидилэтаноламин и N-стеароилфосфатидилэтаноламин, все реагировали с Kм между 2–4 микромолярный и VМаксимум от 73 до 101 наномоль на миллиграмм в минуту по расчету Заговор Лайнуивера – Берка.[2] (Они генерируют N-пальмитоилэтаноламин, анандамид, N-олеоилэтаноламин и N-стеароилэтаноламин соответственно). Фермент также реагировал с N-пальмитоил-лизофосфатидилэтаноламином и N-арахидоноил-лизофосфатидилэтаноламином с аналогичными Kм но от одной трети до одной четвертой VМаксимум. Эти действия согласуются с наблюдением, что многие ткани производят ряд N-ацилэтаноламины.

Однако NAPE-PLD не мог производить обнаруживаемые фосфатидная кислота из фосфатидилхолин или же фосфатидилэтаноламин как катализируется другими фосфолипаза D ферменты. Ему также не хватает активности трансфосфатидилирования фосфолипазы D, которая позволяет создавать фосфатидиловые спирты, а не фосфатидную кислоту в присутствии этиловый спирт или же бутанол.

Путь

Этот фермент действует как вторая ступень биохимического пути, инициированного созданием N-ацилфосфатидилэтаноламин, посредством переноса ацильной группы от sn-1 позиция глицерофосфолипид на аминогруппу фосфатидилэтаноламин.[2] В то время как NAPE-PLD участвует в биосинтезе нескольких NAE у млекопитающих Центральная нервная система, неясно, не отвечает ли этот фермент за образование эндоканнабиноид анандамид, поскольку НАПЭ-ПЛД нокаутные мыши сообщалось, что уровни анандамида дикого типа или очень низкие.[6]

В N-ацилэтаноламины высвобождаемые этим ферментом, становятся потенциальными субстратами для амид гидролаза жирных кислот (FAAH), который гидролизует Свобода жирные кислоты из этаноламин. Дефекты этого фермента могут привести к тому, что продукты NAPE-PLD, такие как анандамид, будут накапливаться до уровней, в 15 раз превышающих обычно наблюдаемые.[7]

Структура

Этот мембранный фермент образует гомодимеры, частично разделенные внутренним каналом шириной ∼9 Å.[8] Металло бета-лактамаза белковая складка адаптирована для связывания с мембраной фосфолипиды. Гидрофобная полость обеспечивает вход для субстрата. НАПЕ в активный центр, где биядерный цинковый центр катализирует его гидролиз. Желчные кислоты связываются с высоким сродством с селективными карманами в этой полости, улучшая сборку димеров и обеспечивая катализ. NAPE-PLD облегчает перекрестные помехи между желчная кислота сигналы и сигналы амидов липидов.[8][9][10]

Рекомендации

  1. ^ Видеть "Энтрес Джин". для более глубокого освещения.
  2. ^ а б c d е ж Окамото Ю., Морисита Дж., Цубои К., Тонай Т., Уэда Н. (февраль 2004 г.). «Молекулярная характеристика фосфолипазы D, производящей анандамид и его родственные». Журнал биологической химии. 279 (7): 5298–305. Дои:10.1074 / jbc.M306642200. PMID  14634025.
  3. ^ Curtiss NP, Bonifas JM, Lauchle JO, Balkman JD, Kratz CP, Emerling BM, Green ED, Le Beau MM, Shannon KM (май 2005 г.). «Выделение и анализ генов-кандидатов миелоидных опухолевых супрессоров из обычно удаляемого сегмента 7q22». Геномика. 85 (5): 600–7. Дои:10.1016 / j.ygeno.2005.01.013. PMID  15820312.
  4. ^ Эгертова М., Саймон Г.М., Краватт Б.Ф., Эльфик М.Р. (февраль 2008 г.). «Локализация экспрессии N-ацилфосфатидилэтаноламинфосфолипазы D (NAPE-PLD) в мозге мышей: новый взгляд на N-ацилэтаноламины как молекулы нервной сигнализации». Журнал сравнительной неврологии. 506 (4): 604–15. Дои:10.1002 / cne.21568. PMID  18067139. S2CID  7770463.
  5. ^ «Аминокислотное секвенирование». W.M. Кека в Йельском университете. 2006-10-23. Получено 2009-01-12. Procise 494 cLC описывается с точки зрения конечного пользователя.
  6. ^ Цубои К., Окамото Ю., Икемацу Н., Иноуэ М., Симидзу Ю., Уяма Т., Ван Дж., Дойч Д. Г., Бернс М. П., Уллоа Н. М., Токумура А., Уэда Н. (октябрь 2011 г.). «Ферментативное образование N-ацилэтаноламинов из плазмалогена N-ацилэтаноламина через N-ацилфосфатидилэтаноламин-гидролизующий фосфолипазу D-зависимые и независимые пути». Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Молекулярная и клеточная биология липидов. 1811 (10): 565–77. Дои:10.1016 / j.bbalip.2011.07.009. PMID  21801852.
  7. ^ Cravatt BF, Demarest K, Patricelli MP, Bracey MH, Giang DK, Martin BR, Lichtman AH (июль 2001 г.). «Сверхчувствительность к анандамиду и усиление эндогенной каннабиноидной передачи сигналов у мышей, лишенных гидролазы амида жирных кислот». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки. 98 (16): 9371–6. Дои:10.1073 / pnas.161191698. ЧВК  55427. PMID  11470906.
  8. ^ а б Маготти П., Бауэр И., Игараши М., Бабаголи М., Маротта Р., Пиомелли Д., Гарау Г. (декабрь 2014 г.). «Структура человеческой N-ацилфосфатидилэтаноламин-гидролизующей фосфолипазы D: регуляция биосинтеза этаноламида жирных кислот желчными кислотами». Структура. 23 (3): 598–604. Дои:10.1016 / j.str.2014.12.018. ЧВК  4351732. PMID  25684574.
  9. ^ Костич М (2015). «Желчные кислоты как регуляторы ферментов». Химия и биология. 22 (4): 427–428. Дои:10.1016 / j.chembiol.2015.04.007.
  10. ^ Маргеритис Е., Кастеллани Б., Маготти П., Перуцци С., Ромео Е., Натали Ф., Мостарда С., Джойелло А., Пиомелли Д., Гарау Г. (октябрь 2016 г.). «Распознавание желчных кислот с помощью NAPE-PLD». ACS Chem Biol. 11 (10): 2908–2914. Дои:10.1021 / acschembio.6b00624. ЧВК  5074845. PMID  27571266.