ДНК-полимераза I - DNA polymerase I

ДНК-полимераза I
PolymeraseDomains.jpg
Функциональные домены во фрагменте Кленова (слева) и ДНК-полимеразе I (справа).
Идентификаторы
Организмкишечная палочка
(ул. К-12, подм. MG1655)
СимволПОЛЬША
Entrez948356
PDB1DPI
RefSeq (Prot)NP_418300.1
UniProtP00582
Прочие данные
Номер ЕС2.7.7.7
Хромосомагеном: 4.04 - 4.05 Мб

ДНК-полимераза I (или же Pol I) является фермент который участвует в процессе прокариотического Репликация ДНК. Обнаружил Артур Корнберг в 1956 г.,[1] это было первое известное ДНК-полимераза (и первая известная полимераза ). Первоначально он был охарактеризован в Кишечная палочка и повсеместно встречается в прокариоты. В Кишечная палочка и многие другие бактерии, ген который кодирует Pol I, известен как ПОЛЬША. В Кишечная палочка форма фермента состоит из 928 аминокислот и является примером процессивный фермент - он может последовательно катализировать множественную полимеризацию без высвобождения одноцепочечной матрицы.[2] Физиологическая функция Pol I в основном заключается в восстановлении любых повреждений ДНК, но он также служит для соединения Фрагменты Окадзаки путем удаления праймеров РНК и замены цепи ДНК.

Открытие

В 1956 г. Артур Корнберг и его коллеги обнаружили Pol I, используя кишечная палочка (Кишечная палочка) экстракты для разработки анализа синтеза ДНК. Ученые добавили 14С-меченый тимидин, чтобы можно было извлечь радиоактивный полимер ДНК, а не РНК. Чтобы начать очистку ДНК-полимеразы, ученые добавили стрептомицин сульфат к Кишечная палочка экстракт, который образовывал осадок, состоящий из супернатанта, не содержащего нуклеиновые кислоты (S-фракция) и содержащего нуклеиновые кислоты осадка (P-фракция). Было обнаружено, что P-фракция содержит Pol I и термостабильные факторы, которые необходимы для реакций синтеза ДНК при экстремальных температурах. Эти факторы были определены как нуклеозидтрифосфаты, строительные блоки нуклеиновых кислот. S-фракция содержала несколько дезоксинуклеозидкиназы.[3] В 1959 году Нобелевская премия по физиологии и медицине была присуждена Артуру Корнбергу и Северо-Очоа "за открытие механизмов биологического синтеза Рибонуклеиновая кислота и Дезоксирибонуклеиновая кислота."[4]

Артур Корнберг 1969

Структура и функции

Общая структура

Pol I в основном выполняет функцию восстановления поврежденной ДНК. Pol I является частью класса белков суперсемейства альфа / бета-белков, который состоит из альфа- и бета-сегментов, которые разбросаны по любому данному белку. Кишечная палочка ДНК Pol I состоит из четырех доменов с двумя отдельными ферментативными активностями. Четвертый домен состоит из экзонуклеаза который проверяет продукт ДНК Pol I и может удалить любые ошибки, допущенные Pol I. Остальные три домена работают вместе, чтобы поддерживать активность ДНК-полимеразы.[5]

Кишечная палочка бактерии содержат 5 различных ДНК-полимераз: ДНК Pol I, ДНК Pol II, ДНК Pol III, ДНК Pol IV и ДНК Pol V. Эукариотические клетки содержат 5 различных ДНК-полимераз: α, β, γ, δ и ε.[6] Эукариотическая ДНК-полимераза β наиболее похожа на Кишечная палочка ДНК Pol I, потому что его основная функция связана с репарацией ДНК, а не с репликацией. ДНК-полимераза β в основном используется для эксцизионной репарации оснований и эксцизионной репарации нуклеотидов.[7] Всего идентифицировано 15 ДНК-полимераз человека.[8]

Структурное и функциональное сходство с другими полимеразами.

Общий связывающий примазу пептид в архейном PolD и эукариотическом Polα

При репликации ДНК ведущая цепь ДНК непрерывно вытягивается в направлении движения репликационной вилки, тогда как запаздывающая цепь ДНК проходит прерывисто в направлении, противоположном направлению движения. Фрагменты Окадзаки.[9] ДНК-полимеразы также не могут инициировать цепи ДНК, поэтому они должны инициироваться короткими сегментами РНК или ДНК, известными как праймеры.[5] Для того чтобы полимеризация ДНК произошла, должны быть выполнены два требования. Прежде всего, все ДНК-полимеразы должны иметь как матричную цепь, так и цепь праймера. В отличие от РНК, ДНК-полимеразы не могут синтезировать ДНК из цепочки матрицы. Синтез должен инициироваться коротким сегментом РНК, известным как Праймер РНК, синтезированный Primase в направлении от 5 футов до 3 футов. Затем происходит синтез ДНК путем добавления dNTP к 3'-гидроксильной группе на конце ранее существовавшей цепи ДНК или праймера РНК. Во-вторых, ДНК-полимеразы могут добавлять новые нуклеотиды к уже существовавшей цепи только за счет водородных связей.[6] Поскольку все ДНК-полимеразы имеют схожую структуру, все они имеют механизм полимеразы, катализируемой ионами двух металлов. Один из ионов металла активирует 3'-гидроксильную группу праймера, которая затем атакует первичный 5'-фосфат dNTP. Второй ион металла стабилизирует отрицательный заряд выходящего кислорода и впоследствии хелатирует две выходящие фосфатные группы.[10]

Считается, что рентгеновские структуры полимеразного домена всех ДНК-полимераз напоминают структуру правой руки человека. Все ДНК-полимеразы содержат три домена. Первый домен, известный как «домен пальцев», взаимодействует с dNTP и парной базой шаблона. «Домен пальцев» также взаимодействует с шаблоном, чтобы правильно разместить его на активном сайте.[11] Второй домен, известный как «пальмовый домен», катализирует реакцию переноса фосфорильной группы. Наконец, третий домен, известный как «домен большого пальца», взаимодействует с двухцепочечной ДНК.[12] Домен экзонуклеазы содержит собственный каталитический сайт и удаляет ошибочно спаренные основания. Среди семи различных семейств ДНК-полимераз «пальмовый домен» консервативен в пяти из этих семейств. «Домен пальца» и «домен большого пальца» несовместимы в каждом семействе из-за различных элементов вторичной структуры из разных последовательностей.[11]

Функция

Pol I обладает четырьмя ферментативными активностями:

  1. А 5'→3' (вперед) ДНК-зависимая активность ДНК-полимеразы, требующая 3 ' грунтовка сайт и нить шаблона
  2. A 3 '→ 5' (реверс) экзонуклеаза деятельность, которая опосредует корректура
  3. A 5 '→ 3' (вперед) экзонуклеазная активность, опосредующая ник перевод в течение Ремонт ДНК.
  4. 5 '→ 3' (прямая) РНК-зависимая активность ДНК-полимеразы. Pol I работает с матрицами РНК со значительно меньшей эффективностью (0,1–0,4%), чем с матрицами ДНК, и эта активность, вероятно, имеет лишь ограниченное биологическое значение.[13]

Чтобы определить, использовался ли Pol I в первую очередь для репликации ДНК или для восстановления повреждений ДНК, был проведен эксперимент с дефицитным мутантным штаммом Pol I. Кишечная палочка. Мутантный штамм, в котором отсутствовал Pol I, был изолирован и обработан мутагеном. У мутантного штамма образовались бактериальные колонии, которые продолжали нормально расти и в которых также отсутствовал Pol I. Это подтвердило, что Pol I не требовался для репликации ДНК. Однако мутантный штамм также проявлял характеристики, включающие чрезвычайную чувствительность к определенным факторам, повреждающим ДНК, таким как УФ-излучение. Таким образом, это подтвердило, что Pol I, скорее всего, будет участвовать в восстановлении повреждений ДНК, а не в репликации ДНК.[6]

Механизм

В процессе репликации РНКаза H удаляет РНК праймер (создано прима ) от отстающая нить а затем полимераза I заполняет необходимые нуклеотиды между Фрагменты Окадзаки (видеть Репликация ДНК ) в направлении 5 '→ 3', исправляя ошибки по ходу дела. Это матричный фермент - он добавляет только те нуклеотиды, которые правильно базовая пара с существующей цепью ДНК, выступающей в качестве матрицы. Очень важно, чтобы эти нуклеотиды имели правильную ориентацию и геометрию для пары оснований с цепью ДНК-матрицы, чтобы ДНК-лигаза может объединять различные фрагменты в непрерывную цепочку ДНК. Исследования полимеразы I подтвердили, что разные dNTP могут связываться с одним и тем же активным сайтом на полимеразе I. Полимераза I способна активно различать разные dNTP только после того, как она подвергается действию конформационное изменение. Как только это изменение произошло, Pol I проверяет правильность геометрии и правильное выравнивание пары оснований, образованной между связанным dNTP и соответствующей основой на цепи шаблона. Правильная геометрия пар оснований A = T и G≡C - единственная, которая может поместиться в активный сайт. Однако важно знать, что каждый десятый4 до 105 нуклеотиды добавлены неправильно. Тем не менее, Pol I может исправить эту ошибку в репликации ДНК, используя свой избирательный метод активного различения.[5]

Несмотря на раннюю характеристику, быстро стало очевидно, что полимераза I не является ферментом, ответственным за большую часть синтеза ДНК - репликацию ДНК в Кишечная палочка происходит примерно со скоростью 1000 нуклеотидов в секунду, тогда как скорость синтеза пар оснований полимеразой I составляет в среднем только от 10 до 20 нуклеотидов в секунду. Более того, его клеточное изобилие, составляющее примерно 400 молекул на клетку, не коррелировало с тем фактом, что обычно их всего два. вилки репликации в Кишечная палочка. Кроме того, недостаточно процессивный скопировать весь геном, так как отваливается после включения всего 25–50 нуклеотиды. Его роль в репликации была доказана, когда в 1969 г. Джон Кэрнс выделила жизнеспособную полимеразу I мутант которые лишены полимеразной активности.[14] Лаборантка Кэрнса, Паула Де Люсия, создала тысячи экстрактов, свободных от клеток, из Кишечная палочка колонии и анализировали их на активность ДНК-полимеразы. 3478-й клон содержал ПОЛЬША мутант, которого Кэрнс назвал в честь «Паулы» [Де Люсия].[15] Так было до открытия ДНК-полимераза III что основная репликативная ДНК-полимераза была наконец идентифицирована.

Приложения для исследований

ДНК-полимераза I: фрагмент Кленова (PDB 1KLN EBI)[16]

ДНК-полимераза I, полученная из Кишечная палочка широко используется для молекулярная биология исследование. Однако активность экзонуклеазы 5 '→ 3' делает его непригодным для многих приложений. Эту нежелательную ферментативную активность можно просто удалить из холофермента, чтобы оставить полезную молекулу, называемую Кленовский фрагмент, широко используется в молекулярная биология. Фактически, фрагмент Кленова использовался во время первых протоколов полимеразной цепной реакции (ПЦР) амплификация до Thermus aquaticus, источник теплостойкого Taq Полимераза I, был открыт в 1976 году.[17] Воздействие протеазы на ДНК-полимеразу I субтилизин расщепляет молекулу на меньший фрагмент, который сохраняет только активность ДНК-полимеразы и корректора.

Смотрите также

Рекомендации

  1. ^ Lehman IR, Bessman MJ, Simms ES, Kornberg A (июль 1958 г.). «Ферментативный синтез дезоксирибонуклеиновой кислоты. I. Подготовка субстратов и частичная очистка фермента от кишечная палочка". Журнал биологической химии. 233 (1): 163–70. PMID  13563462.
  2. ^ Воет Д., Воет Дж. Г., Пратт К. В. (1999). Основы биохимии. Нью-Йорк: Вили.[страница нужна ]
  3. ^ Lehman IR (сентябрь 2003 г.). «Открытие ДНК-полимеразы». Журнал биологической химии. 278 (37): 34733–8. Дои:10.1074 / jbc.X300002200. PMID  12791679.
  4. ^ "Нобелевская премия по физиологии и медицине 1959 г.". www.nobelprize.org. Получено 2016-11-08.
  5. ^ а б c Кокс ММ, Дудна Дж (2015). Молекулярная биология (2-е изд.). Нью-Йорк: W.H. Фримен.[страница нужна ]
  6. ^ а б c Купер, Джеффри М. Джеффри (01.01.2000). «Репликация ДНК». Цитировать журнал требует | журнал = (помощь)
  7. ^ Wood RD, Shivji MK (апрель 1997 г.). «Какие ДНК-полимеразы используются для репарации ДНК у эукариот?». Канцерогенез. 18 (4): 605–10. Дои:10.1093 / carcin / 18.4.605. PMID  9111189.
  8. ^ Biertümpfel C, Zhao Y, Kondo Y, Ramón-Maiques S, Gregory M, Lee JY, Masutani C, Lehmann AR, Hanaoka F, Yang W (июнь 2010 г.). «Структура и механизм ДНК-полимеразы человека эта». Природа. 465 (7301): 1044–8. Bibcode:2010Натура.465.1044Б. Дои:10.1038 / природа09196. ЧВК  2899710. PMID  20577208.
  9. ^ Хюбшер У., Спадари С., Виллани Дж., Мага Дж. (2010). ДНК-полимеразы. Дои:10.1142/7667. ISBN  978-981-4299-16-9.[страница нужна ]
  10. ^ «ДНК-полимераза I: ферментативные реакции».
  11. ^ а б «MBIO.4.14.5». bioscience.jbpub.com. Получено 2017-05-14.
  12. ^ Леб Л.А., Моннат Р.Дж. (август 2008 г.). «ДНК-полимеразы и болезни человека». Природа Обзоры Генетика. 9 (8): 594–604. Дои:10.1038 / nrg2345. PMID  18626473.
  13. ^ Ricchetti M, Buc H (февраль 1993 г.). "Кишечная палочка ДНК-полимераза I как обратная транскриптаза ». Журнал EMBO. 12 (2): 387–96. ЧВК  413221. PMID  7679988.
  14. ^ Де Люсия П., Кэрнс Дж. (Декабрь 1969 г.). "Изоляция Кишечная палочка штамм с мутацией, влияющей на ДНК-полимеразу ». Природа. 224 (5225): 1164–6. Bibcode:1969Натура.224.1164Д. Дои:10.1038 / 2241164a0. PMID  4902142.
  15. ^ Фридберг ЕС (февраль 2006 г.). «Фермент эврика: открытие ДНК-полимеразы». Обзоры природы Молекулярная клеточная биология. 7 (2): 143–7. Дои:10.1038 / nrm1787. PMID  16493419.
  16. ^ EMBL-EBI. «Европейский институт биоинформатики EMBL». www.ebi.ac.uk. Получено 2016-11-08.
  17. ^ ван Пелт-Веркуил Э, ван Белкум А, Хейс JP (2008). «Taq и другие термостабильные ДНК-полимеразы». Принципы и технические аспекты амплификации ПЦР. С. 103–18. Дои:10.1007/978-1-4020-6241-4_7. ISBN  978-1-4020-6240-7.